Untersuchungen über die Katalaseaktivität des Blutes und ihre Abhängigkeit vom Hämoglobingehalt, Anzahl der roten Blutkörperchen und deren Zellvolumenprozent.

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    25-Sep-2016

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<ul><li><p>Acta Medica Scandinavica. Vol. XCII, fasc. IV-V, 1937. </p><p>Aus dem Kinderspital Fuglebakken, Kopenhagen. (Direktor Dr. med. Vaidemar Poulsen). </p><p>Untersuchungen iiber die Katalaseaktivitat des Blutes und ihre Abhangigkeit vom .Hamoglobin- gehalt, Anzahl der roten Blutkorperchen und </p><p>deren Zellvolumenprozent. Von </p><p>BENT ANDERSEN. (Bei der Redaktion am 4. Mai 1937 eingegangen.) </p><p>Einleitung . Das menschliche Blut ist bekanntlich irn Stande, Wasser- </p><p>stoffperoxyd in Wasser und Sauerstoff zu spalten. Diese Eigen- schaft des Blutes ist vornehmlich der Gegenwart des Enzymes Katalase zuzuschreiben, welches sich in den Formelementen des Blutes, namlich den roten und weissen Blutkorperchen, sowie den Thrombocyten findet; das Blutplasma ist katalasefrei. K. G. Stern (1) hat gezeigt, dass die Katalaseaktivitaten der Leucocyten und Erythrocyten von der gleichen Grossenordnung sind; Iglauer (2) gibt an, dass die Leukocyten etwa dreimal soviel Katalase enthalten, wie die Erythrocyten. Die katalatische Aktivitat der Thrombocyten endlieh ist nach Untersuchungen von Iglauer und Weber (3) etwa 100 Male geringer als die der Leukocyten. Aus dieser Sachlage geht hervor, dass die wasserstoffperoxyd- spaltende Aktivitat des Blutes bei normalen Individuen ganz uberwiegend auf dem Erythrocytengehalt des Blutes beruht, da die Anzahl der roten und weissen Blutkorperchen sich normaler- 25 - Acta med. scandinau. Val. X C I I . </p></li><li><p>376 BENT hf fDERSEN. </p><p>weise wie 500: 1 verhalt. Das Hamoglobin hat, wie von Haurowitz (4) gezeigt wurde, ebenfalls katalatische Wirkung, welche jedoch im Vergleich mit der Aktivitat der eigentlichen Katalase ganz unbedeutend ist. </p><p>Ober die Bedeutung der Katalase im Organismus ist nur sehr wenig bekannt. Vieles deutet darauf hin, dass dieses Enzym an der Atmung der Zellen mitwirkt und also der Gruppe der soge- nannten nAtmungsenzyme)) apgehort, doch weiss man nichts naheres daruber. Man hat vermutet, dass die Funktion der Katalase darin bestehe, das im Organismus gebildete toxische Wasserstoffperoxyd durch Spaltung zu entfernen, oder darin, die Abgabe des Sauer- stoffs durch das Hamoglobin zu katalysieren, doch liegen keine Beweise fur diese Annahmen vor. </p><p>Die medizinische Forschung hat sich in zahlreichen Arbeiten mit der katalatischen Aktivitat des Blutes beschaftigt, und hat charakteristische Veranderungen dieser Eigenschaft bei verschie- denen krankhaften Zustanden nachzuweisen gesucht. Die Ausbeute dieser Arbeiten war jedoch sehr gering. In zahlreichen Fallen hat man gemeint, eine Verminderung der katalatischen Aktivitat des Blutes nachweisen zu konnen, so z. B. bei Kachexien verschie- dener Herkunft, bei Vitaminmangel, Tuberkulose, Tumoren, Diabetes, langwierigem Fieber u. s. w. </p><p>Die allermeisten dieser Arbeiten sind ohne Berucksichtigung eines oder mehrerer fur die Katalaseaktivitat bedeutungsvollen Faktoren ausgefiihrt worden. Zahlreiche Versuche wurden ohne Regelung von pH und Temperatur angestellt, oft war die Ver- suchstemperatur so hoch und die Wasserstoffperoxydkoncentra- tion so gross, dass wahrend der Versuchsdauer eine merkbare Zerstorung des Enzyms stattfinden musste. Als Beispiel kann eine Arbeit angefuhrt werden, bei der die Versuchsbedingungen waren: Substrat 0.2 n H,Os-Losung, Versuchszeit 2 Stunden bei 37", keine 'Regelung des pH. </p><p>Ferner wurde bei den meisten Arbeiten fehlerhafterweise an- genommen, dass zwischen der Katalaseaktivitat und der nach einer gewissen Zeit gespaltenen Wasserstoffperoxydmenge direkte Proportionalitat bestehe. Man hat sich daher damit begnugt, die nach einer gewissen Zeit gespaltene Wasserstoffperoxydmenge zu bestimmen und hat hieraus auf die Katalaseaktivitat geschlossen. Es ist nicht verwunderlich, dass man unter diesen Umstanden zu </p></li><li><p>U N T E R S U C H U N G E N ~ B E R D I E K A T A L A S E A K T I V I T ~ T D E S BLUTES USW. 377 </p><p>sehr verschiedenen Ergebnissen kam, die teilweise einander wider- sprechen. Als Mass fur die Katalaseaktivitat des Blutes wird haufig die sogenannte Katalasezahl angewendet, welche angibt, wie viele Gramm Wasserstoffperoxyd von einer gewissen Blut- menge unter gewissen Versuchsbedingungen gespal ten werden. Es ist einleuchtend, dass die absolute Grosse der Katalasezahl von den Versuchsbedingungen abhangt und dass die von verschiedenen Untersuchern unter verschiedenen Versuchsbedingungen gefun- denen Werte nicht ohne weiteres vergleichbar sind. Ferner muss man annehmen, dass zwischen der katalatischen Aktivitat des Blutes und dessen Gehalt an roten Blutkorperchen ein Zusammen- hang besteht, da es vor allem die letzteren sind, welche die Katalase- aktivitat verursachen. Man wird daher bei Anamien ver- schiedenster Herkunft ganz allgemein niedrige Katalasezahlen erwarten konnen, wie z. B. bei Cancer, Tuberkulose, Nephritis u. s. w. Es braucht kaum hervorgehoben zu werden, dass ein solcher Befund keinen differentialdiagnostischen Wert hat. Diese Sachlage ist jedoch von mehreren Autoren ubersehen worden. Van Thienen (5 ) hat, ausgehend von der Erkenntnis, dass der Nachweis von Variationen der Katalasezahl ohne gleichzeitige Kenntnis der Variationen des Erythrocytengehaltes in diagno- stischer Beziehung wertlos ist, den Begriff des Katalaseindexes eingefuhrt. Diese Grosse bezeichnet die Anzahl von Milligrammen gespaltenen Wasserstoffperoxydes pro Million Erythrocyten. Der Katalaseindex variiert, wie van Thienen zeigte, bei gesunden Individuen nur wenig und zeigte sich auch bei Patienten mit Anamien verschiedener Herkunft normal, selbst wenn die Katalase- zahl niedrig war. Bei anaemia perniciosa hingegen fand van Thie- nen den Katalaseindex betrachtlich erhoht. Van Thienens Ergeb- nisse sind oftmals nachgepruft, und bisweilen bestatigt, bisweilen angegriffen worden. Hierzu ist zu bemerken, dass die angewende- ten Versuchsmethoden, wie erwahnt, in vielen Fallen zu Losung der Probleme ganz unzureichend waren. Ferner wurde die Bestim- mung der Katalaseaktivitat und die Zahlung der roten Blut- korperchen nicht mit derselben stabilisierten Blutprohe ausge- fuhrt, sondern mit verschiedenen, direkt einem Hautschnitt ent- nommenen Bluttropfchen, deren Gehalt an roten Blutkorperchen bekanntlich nicht unbetrachtlich variieren kann. </p><p>Unter diesen Umstanden schien es mir der Miihe wert, das </p></li><li><p>378 B E N T A N D E R S E N . </p><p>Studium der hier geschilderten Probleme nochmals aufzunehmen unter Anwendung einer Methodik, die unser gegenwartiges Wissen uber die Eigenschaften der Katalase berucksichtigt. Da man von vornherein keine absolute Proportionalitat zwischen der Katalase- aktivitat und der Anzahl der roten Blutkorperchen erwarten konnte, indem das Verhaltnis dieser beiden Grossen ja sowohl von der Grosse der Erythrocyten als auch von deren Katalasekonzentration abhangen muss, wurde sowohl Zahl wie Grosse der Erythrocyten (durch Hamatokritmessungen) bestimmt. Zu samtlichen Unter- suchungen (Bestimmung von Katalaseaktivitat, Hamoglobin- gehalt, Zellvolumenprozent und Erythrocgtenzahl) wurde Heparin- blut verwendet. </p><p>Methodik. </p><p>a. Hiimatologische Untersuchungen. </p><p>Samtliche Untersuchungen wurden mit Heparinblut durch- gefiihrt, welches Erwachsenen durch Venenpunktur, grosseren Kindern durch einen Stich in die Fingerkuppe, und Sauglingen durch einen Stich in die Ferse entnommen wurde. Das Blut wurde in einem kleinen Gefasse aufgefangen, in welches vorher 10 mm3 einer 5 %igen Heparinlosung einpipettiert und im Trockenschranke eingedampft worden waren. In der Regel wurden 2-4 cm3 Blut entnommen. Durch Vorversuche wurde festgestellt, dass das ver- wendete Heparinpraparat selbst in weit grosseren Mengen, als den im Versuch beniitzten, keine katalatische Aktivitat besass. Das Blut wurde meist sofort nach der Entnahme weiterverarbeitet, doch konnte es, wie durch Versuche festgestellt wurde, auch 24 Stunden ohne Aktivitatsverlust im Eisschrank aufbewahrt werden. </p><p>Die Hiimoglobinbestimmungen wurden mit Hilfe eines Universal- kolorimeters nach Hellige mit fester Lichtquelle ausgefiihrt, das nach Haldane standardisiert worden war (18.5 Vol. % Sauerstoff = 100 % Hamoglobin). Bei der Umrechnung der Hamoglobin- prozente auf g Hamoglobin in 100 cms Blut nahm ich, wie iiblich, an, dass 1 g Hamoglobin zur Bindung von 1.34 cm3 Sauerstoff befahigt ist. </p><p>Die Ziihlung der roten Blutkorperchen wurde in einer Zahl- kammer nach Biirker-Turk ausgefiihrt, wobei 1,000-2,000 Zellen gezahlt wurden. Zur Bestimmung der Zellvolumenprozente </p></li><li><p>UNTERSUCHUNGEN UBER DIE KATALASEAKTIVITKT DES BLUTES usw. 379 </p><p>diente van Allens Hamatokrit (Doppelbestimmungen). Die Erythro- cyten wurden in der von Christensen und Warburg (6) angegebenen Losung aufgeschlemmt. Einige Zablungen wurden vom Rutine- assistenten des Spitales ausgefiihrt, alle anderen Untersuchungen auch die enzymatischen, habe ich selbst vorgenommen. Der durchschnittliche Hamoglobingehalt der Erythrocyten, sowie deren durchschnittliches Volumen und Hamoglobinkonzentration wurde in Obereinstimmung mit Wintrobes (7) Vorschlag in absoluten Zahlen ausgedriickt. </p><p>b. Besfimmung der Katalaseaktivitat. </p><p>Die Katalaseaktivitat wurde bestimmt durch jodometrische Titration des nach verschiedenen Einwirkungszeiten ungespalten verbliebenen Wasserstoffperoxyds. Die Methode beruht darauf, dass Wasserstoffperoxyd in saurer Losung eine aquivalente Menge Jod aus einer Kaliumjodidlosung in Freiheit setzt. Das Verfahren wurde schon vor vielen Jahren von Jolles (8) angewendet und vor kurzem von K. G . Stern (l), dessen Angaben ich mit einer kleinen Abanderung gefolgt bin, wieder aufgenommen. </p><p>Der Versuchsansafz ist folgender: 35 cm3 ca. 0.01 mol Wasserstoff- peroxydlosung (bereitet aus 0.5 cm3 Perhydrol Merck durch Ver- dunnung mit Wasser auf 500 cm3) + 10 cm3 Phosphatpuffer (5 cm3 prim. + 5 cm3 sek. Phosphat, pH 6.81) + 4 cm3 Wasser + 1 em3 Enzymlosung, im Ganzen 50 cm3. </p><p>Die EnzymIosung wurde unmittelbar vor Versuchsbeginn durch Verdiinnung (mit Wasser) und dadurch bewirkte Hamolysie- rung von 10 oder 20 mm3 Blut in einem 20 cm3-Messkolben bereitet. Zu den Versuchen diente stets 1 cm3 dieser Enzym- losung. </p><p>Die Versuche wurden bei 0" ausgefiihrt. Enzymlosung und Substrat wurden vor dem Vermischen auf 0" gekiihlt. Zur Ver- dunnung des Blutes darf nur eiskaltes Wasser benutzt werden, da die Aktivitat der Blutkatalase heim Verdunnen mit Wasser von Zimmertemperalur schnell und stark abnimmt. Genau 1,6, 11 und 16 Minuten nach dem Vermischen von Enzym und Substrat wurden der Mischung Proben von je 5 cm3 entnommen und in einen Erlenmeyerkolben einpipettiert, der 10 cm3 1 yoiger Kalium- jodidlosung, 3 cm3 33 yoiger Schwefelsaure und 3 Tropfen einer </p></li><li><p>380 BENT ANDERSEN. </p><p>gesattigten wassrigen Molybdansaurelosung enthielt. Der Zusatz der letzteren beschleunigt die Freisetzung des Iods durch Wasser- stoffperoxyd. Titriert wurde mit 0.02 n-Natriumthiosulfatlosung und jede Titration wurde im Laufe von genau 7 Minuten zu Ende gefuhrt. Als Indikator diente die ubliche Starkelosung: der Um- schlag war stets ungemein scharf. Als Nullwert wurde der Natrium- thiosulfatverbrauch einer Losung bestimmt, die sich von den an- deren Proben nur dadurch unterschied, dass sie mit 1 cms durch Kochen inaktivierter Enzymlosung angesetzt worden war. </p><p>Berechnung der Kafalaseaktivifat. Die Geschwindigkeit der durch Katalase katalysierten Spaltung von Wasserstoffperoxyd lasst sich unter gewissen Umstanden (besonders wichtig sind niedrige Temperatur und niedrige Wasserstoffperoxydkonzentra- tion) durch die Konstante der fur monomolekulare Reaktionen geltenden Gleichung ausdrucken: </p><p>wobei t die Versuchszeit in Minuten, a die im Blindversuch ver- brauchte Menge Natriumthiosulfat und a - x die nach der Zeit t zur Titration verbrauchte Natriumthiosulfatmenge bezeichnet. Die ursprunglich von Sentner (9) angegebene Charakterisierung der Katalaseaktivitat durch die Geschwindigkeitskonstante der monomolekularen Spaltungsreaktion ist spater von vielen an- deren Verfassern benutzt worden, und muss als die zur Erlangung vergleichbarer Resultate am besten geeignete Darstellungsweise bezeichnet werden. Gleich beim Beginn der vorliegenden Arbeit zeigte es sich, dass die Reaktionskonstante wahrend der Dauer des Versuches infolge von Enzymdestruktion immerhiii so stark ab- aahm, dass der Mittelwert der nach 1 , 6, 11 und 16 Minuten langeii Versuchszeiten gefundenen Konstanten nicht als befriedigendes Mass der Enzymaktivitat betrachtet werden konnte. Doch war die Abnahme der Konstanten so regelmassig, dass es moglich war, durch graphische Extrapolation deren Wert fur die Zeit 0 zu bestimmen. Dieser Wert wurde als Mass fur die katalatische Aktivitat der betreffenden Enzymlosung angesehen. Tabelle 1 zeigt an einem typischen Beispiel das Verhalten der Reaktions- konstanten unter den bei dieser Arbeit benutzten Versuchs- bedingungen. </p></li><li><p>UNTERSUCHUNGEN U B E R DIE KATALASEAKTIVITAT DES BLUTES USW. 381 Tabelle 1. </p><p>Zeit in Minuten cms Na-thiosulfat k x 10' 0 3.864 197 1 3.70 183 6 3.08 164 </p><p>11 2.639 151 16 2.29 142 </p><p>Da die Extrapolation auf k, zu Fehlern Anlass geben kann, wurde versucht, sie durch Anwendung von verdiinnteren Wasser- stoffperoxydlosungen zu umgehen, in der Hoffnung, den Gang der Reaktionskonstanten hierdurch zu eliminieren. Tabelle 2 gibt das Ergebniss dieser Versuche wieder. Zu allen dreien in der Tabelle angefuhrten Versuchen wurde die gleiche Probe von Hepa- rinblut in der Verdiinnung 0.1 : 20 verwendet. </p><p>Tabelle 2. Versuch 1. Versrrch 2. </p><p>Perhydrollosg. 0.01 mol Perhydrollosg. 0.005 mo: Zeit in Min. cm* Na-thiosulf. 0.02 II k x 1 0 4 cma Na-thiosulf. 0.02 n k x 10' </p><p>0 1 6 </p><p>11 16 </p><p>Zeit in Min 0 1 G </p><p>11 16 </p><p>3.88 103 3.79 101 3.41 93 3.117 87 2.88 81 </p><p>Versuch 3 Perhydrolldsg. 0.0025 mol ,ma Na-thiosulf. 0.001 II </p><p>1.90 1.855 1.645 1.46 1.31 </p><p>1.94 103 1.895 102 1.695 98 1.53 94 I .393 90 </p><p>k x 104 104 104 104 104 101 </p><p>Die in Versuch 3 gefundene Konstanz von k bei Anwendung einer 0.0025 mo1.-Perhydrollosung konnte, wie sich bei der Unter- suchung anderer Blutproben zeigte, nur ausnahmsweise verwirk- licht werden. Er wurden daher die oben angefiihrten Versuchs- bedingungen und die graphische Extrapolation auf k, beibehalten. Die Versuche bestatigen die wohlbekannte Tatsache, dass die Reaktionskonstante innerhalb weiter Grenzen von der Wasserstoff- peroxydkonzentration unabhangig ist. </p></li><li><p>382 BENT ANDERSEN. </p><p>Wie aus den in Tabelle 3 wiedergegebenen Versuchen hervor- geht, sind die sc,hliesslich gewahlte Versuchsanordnung und die Charakterisierung der Katalaseaktivitat durch k, befriedigend fur die Zwecke der vorliegenden Arbeit. k andert sich namlich, wie man sieht, praktisch proportional mit der relativen Enzym- konzentration. </p><p>Tabelle 3. k x 10' </p><p>Relative Enzymkonz. Versuch 1 Versuch 2. Versuch 3. Versuch 4. 1 144 251 269 400 0.5 75 121 134 198 0.33 132 </p><p>Bei der Ausfuhrung der vorliegenden Arbeit bin ich auf keine weiteren ernstlichen Fehlerquellen gestossen. Das Studium der medizinischen Literatur iiber Blutkatalase legt es jedoch nahe, darauf hinzuweisen, dass die Katalaseaktivitat einer Blutprobe beim...</p></li></ul>

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