Pourquoi un diagnostic du paludisme ?

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    26-Dec-2014

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Pourquoi un diagnostic du paludisme ? - Confrence de la 1re dition du Cours international Atelier Paludisme - FANDEUR Thierry

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  • 1. Pourquoi un diagnosticdu paludisme ? Bnfice pour le malade Bnfice pour la communaut Adaptation du traitement Matrise des rsistances
  • 2. Comment ?Diagnostic de prsomptionDiagnostic direct Microscopie QBC Test rapide ou dipstick PCRDiagnostic indirect ou srologique
  • 3. 1 . Diagnostic prsomptif Circonstances Elments dorientation Epidmiologiques Cliniques Biologiques Avantages Inconvnients
  • 4. 2. Diagnostic direct Se fait partir du sang Quand effectuer le prlvement ? Combien de prlvements ? Procdure et prcautions Au moment du prlvement : gants, matriel jetable, etc. Transport des prlvements Traitement au laboratoire
  • 5. 2. Diagnostic direct1 Mise en vidence du parasite : Microscopie Quantitative Buffy Coat (QBC) Cytomtrie de flux2 Mise en vidence dag parasitaire Test rapide sur bandelette (dipstick) ELISA, RIA3 Mise en vidence dADN parasitaire PCR Sondes nucliques
  • 6. 2.1.a Microscopie La goutte paisse et le frottis Ralisation pratique La coloration Giemsa Autres colorations Points techniques importants
  • 7. 2.1.a Microscopie La lecture au microscope Sensibilit de la mthode et expression de la densit parasitaire Pour 100 champs de microscope soit 10 min. de lecture nb de GR nb de GB volume examin sensibilit Frottis 5x 10 4 60 0,01 l 100-200 para /lGoutte paisse 1x 10 6 1200 0,2 l 10-20 para /l1 l de sang il y a environ 5 000 000 de GR et 6000 GB
  • 8. 2.1.a MicroscopieLa lecture au microscope Les formes parasitaires
  • 9. 2.1.a Microscopie La lecture au microscope Les espces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm Distribution htrogne Diagnostic despce sur la base de critres morphologiques
  • 10. 2.1.a Microscopie Avantages Faible cot Morphologie (stades, espces) Bonne sensibilit Quantitatif Lecture rtrospective
  • 11. 2.1.a Microscopie Inconvnients Dlai Personnel expriment Equipement Problme des infections mixtes
  • 12. 2.1.b QBCPrincipeSang au bout du doigtTube capillaire+Acridine OCentrifugationLecture microscope UV FLUORESCENCESensibilitVolume examin : 60 l vs 0.2 l GESensibilit 1 para/l
  • 13. 2.1.b QBC P vivax P falciparumP falciparum P vivax+ granulocytes Pf gametocyte
  • 14. 2.1.b QBC Avantages Rapidit Bonne sensibilit Inconvnients Toxicit de lacridine, cot lev Equipements Personnel expriment Pas appropri au terrain Pas quantitatif, espces ?
  • 15. 2.1.c CytomtrieMarquage des cellules avec un colorantfluorescent : Hoechst ou thiazole orangeTri des cellules en fonction de lafluorescence et de la tailleEvaluation de la parasitmie. Trs bonnesensibilit mais bruit de fond important daux rticulocytesUtilise couple avec immunofluorescencede surface pour analyse phnotypique GRP
  • 16. 2.2.a Test Rapid Dipstick Principe : Dtection dantignes parasitaires par immunochromatographie Rcolte du sang au bout du doigt Lyse du sang Migration des antignes librs Dtection avec un ou plusieurs Acmx marqus
  • 17. 2.2.a Test Rapid Dipstick
  • 18. 2.2.a Test Rapid DipstickQuels antignes ? HRPII P.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck) Trophozoites et jeunes gamtocytes Fonction de dtoxification de lhme ? pLDH Antigne non spcifique (OptiMal) Tous les stades Autres utilisations Alternative aux mthodes isotopiques
  • 19. 2.2.a Test Rapid Dipstick Sensibilit >95% (compar la microscopie 100%) 100 % pour Pf pour des densits >300 p/l Sensibilit moindre pour Pv (autres espces ?)
  • 20. 2.2.a Test Rapid Dipstick Spcificit Autour de 90% Faux positifs (HRPII essentiellement)
  • 21. 2.2.a Test Rapid Dipstick Avantages Rapide : 5 min. Peut tre ralis sans exprience Bonne sensibilit et bonne spcificit Ne ncessite pas dquipements spcifiques Adapt au terrain
  • 22. 2.2.a Test Rapid Dipstick Inconvnients Cot : 1-2 USD. Pas quantitatif Ne distingue pas Pv des autres espces Stabilit des ractifs sur le terrain ? Nombre important de faux positifs Ne donne pas dindication sur la viabilit des parasites
  • 23. 2.2.a Test RapidDipstick
  • 24. 2.2.b RIA et ELISA Principe : Dtection dantignes para- sitaires Utilisation danticorps monoclonaux Technique en sandwich Pas dintrt rel pour le diagnostic Utilisables pour la dtection de sporozoites chez les vecteurs
  • 25. 2.3 Diagnostic Molculaire Principe ADN du parasite PCR et /ou hybridation Choix de squences cibles avec rgions polymorphes et conserves Analyse
  • 26. 2.3.a Diagnostic Molculaire DIAGNOSTIC PAR PCR SSUrRNA genes PRIMAIRE SECONDAIRES Spcifiques 1 de genre P. sp P . falciparum 2 P. vivax Spcifiques P. malariae despces P. ovale
  • 27. 2.3.a Diagnostic Molculaire 1. Amplification spcifique de genre 1 2 3 4 5 6 Pf Pv Po PM Pri Sec
  • 28. 2.3.a Diagnostic Molculaire 2. Amplifications spcifiques despce V M F O
  • 29. 2.3.a Diagnostic Molculaire Avantages Petit prlvement : blood spot ADN utilisable pour gnotypage, clonage Caractrisation fine par squenage Bonne sensibilit : 1-3 parasites par l Bonne spcificit : proche de 100 % Dtection de formes parasitaires atypiques Etudes rtrospectives Partiellement automatisable Semi-quantitatif
  • 30. 2.3.a Diagnostic Molculaire Inconvnients Temps ncessaire pour lanalyse Cot Equipement Bonne technicit (contaminations)
  • 31. 2.3.b Sondes Molculaires Principe Extraction ADN Spotting Dnaturation / neutralisation Hybridation avec des sondes marques Lecture Commentaires Squences rptes SSurRNA, rep 20 ou Tel Quantits importantes dADN
  • 32. Comparaison des mthodes Parasites Ag parasitaires ADNMthodes Microscopie QBC HRPII pLDH PCRExpertise +++ ++ - - ++++Equipement + +++ - - ++++Temps ++ + - - ++++Diagnostic despce +++ + Pf Pf /non Pf ++++Adaptation terrain + - ++++ ++++ -Enqutes +++ - - - ++++Quantification ++++ + - - ++Sensibilit +++ +++ ++ ++ ++++Spcificit +++ + + ++ ++++Standardisation Meth +++ ++ ++ ++ +Cot (USD) 0,05 2,0-4,0 2 2 2 Points forts Points faibles Intermdiaire
  • 33. 3. Diagnostic srologique Principe : Recherche danticorps spcifiques Dtection du complexe ag/ac par 1 . Immunofluorescence indirecte 2 . Elisa 3 . Radioimmunoanalyse 4 . Test srologique sur bandelette
  • 34. 3.1 IF indirecte Parasites fixs lairou lactone Dilutions du srum Anti-anticorpsfluorescent Mesure de lextinctionde la fluorescence :titre en Ac spcifiques
  • 35. 3.2 ELISA Ag parasitaire brut, ou fraction purifie,ou peptide synthtique Dilutions du srum Anti-anticorps marqu par un enzyme Rvlation de lactivit enzymatique Mesure des DO Titre en anticorps spcifiques par rapport un seuil.
  • 36. 3. 3 ELISA Exemple dinhibition de la ractivit danticorps spcifiques Anti-CSP par le peptide synthtique homologue Pf et par le peptide htrologue Pm correspondant
  • 37. 3. 3 RIA Comparable aux autres tests dans laconception : Gamme de dilutions des srums Anti-anticorps marqu avec isotope * Mesure des cpm Titre en Ac spcifiques par rapport un seuil
  • 38. 3.3 Dipsticks pour srologie Format dipstick Dtection qualitative des Ac spcifiques dans le sang, plasma ou srum. Spcifique pour Pv et Pf Sensibilisation du support avec les Ag CSP et MSP1 Enqutes pidmiologiques
  • 39. 3.4 Utilit de la srologie ? Pas dintrt pour le diagnostic sauf : Criblage des donneurs de sang Complment dinformation chez un patient suspect de paludisme mais avec gouttes paisses ngatives Diagnostic despce rtrospectif
  • 40. PISTES DE RECHERCHEAmliorations possibles Tests rapides Lecture quantitative Caractrisation des espces Amliorer la sensibilit et la spcificit Instaurer un contrle qualit Dvelopper une banque de ractifs pour tester la qualit des dispticks Combiner sur la mme bandelette un diagnostic paludisme et Dengue
  • 41. PISTES DE RECHERCHEAmliorations possibles PCR Standardiser la mthode Dvelopper un kit PCR de diagnostic Automatiser la mthode pour des tudes grande chelle
  • 42. PISTES DE RECHERCHERecherche Tests rapides Etudier la persistances des antignes HRPII et pLDH aprs le traitement. Etudier le polymorphisme HRPII et pLDH chez des parasites sauvages. Dvelopper dautres systmes antigniques pour la dtection spcifique des stades asexus et sexus
  • 43. PISTES DE RECHERCHERecherche Tests rapides Evaluer la possibilit de mise au point dun test rapide pour dterminer la sensibilit dun isolats un mdicament Etudier la dure de validit des dipsticks dans les conditions du terrain

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