Intérêt et limites du diagnostic sérologique des mycoses

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    17-Sep-2016

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Analyses serologiques sp6cifiques au cours de processus infectieux : int~r#ts et Iim#es INTI RI T ET LIMITES DU DES MYCOSES DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE Marie-Helene Bessi~res a,*, Marie-Denise Linas a, Sophie Cassaing a R~sumd Dans le cadre du depistage des mycoses profondes, aspergilloses, candidoses et cryptococcoses ou des pneumopathies d'hypersen- sibilite, le diagnostic serologique est indispensable. La fr6quence des examens et les methodes & preconiser varient en fonction des pathologies. La mise en evidence d'anticorps specifiques et d'antigenes circulants est necessaire pour depister les mycoses invasives souvent fatales chez les patients fortement immuno- d6primes. Cela impose un suivi serologique regulier des patients & risque. Les resultats positifs doivent ~tre confrontes aux donnees biocliniques. En particulier, des faux positifs sont observes dans la detection d'antig6nes circulants Iors du diagnostic d'aspergillose invasive. Du fait de leur sensibilit6, les methodes immunoenzyma- tiques ont amelior~ ce diagnostic. Le diagnostic serologique doit 6tre associe au diagnostic mycologique. II peut, en effet dans cer- taines situations pathologiques, authentifier une mycose profonde alors que I'agent pathogene est difficile & isoler en culture. II per- met, dans ce cas, une mise en traitement precoce par des antifon- giques. D~pis tage des mycoses profondes - aspergi l loses - candi- doses - cryptococcoses - pneumopath ies d 'hypersensib i - lit(~ - d iagnost ic sdro log ique - ant icorps - ant ig~nes circu- lants. Summary : In teres t and l imi ts o f invas ive funga l in fec t ions d iagnos is For diagnosing invasive fungal infections, aspergillosis, candi- diasis and cryptococcosis or extrinsic allergic alveotitis, immu- nological diagnosis is essential. The frequency of samples and tests recommended for this diagnosis differ in function of pathology. The detection of specific antibodies and cffculating antigens is required for the diagnosis of invasive mycosis fre- quently fatal in immunocompromised patients. A serological fol- low-up of these patients is necessary. Positive results must be compared with clinical signs. Particularly, false positive tests for Aspergillus antigenaemia were observed in the diagnosis of invasive aspergillosis. a Laboratoire de parasitelogie-rnycologie Centre hospitalier universitaire Rangueil 1, av. Jean-Poulhes - TSA 50032 B1059 Toulouse cedex 9 * Correspondance bessieres.rnh@chu-teulouse.fr article re~:u le 8 avril, accept(~ le 23 ao,~t 2004. Elsevier SAS. Enzyme-linked immunosorbent assays have improved this dia- gnosis because they are more sensitive. Serological diagnosis must be used in association with mycological diagnosis. It can be positive even when fungal cultures were negative. It allows, in that case, an early antifungal therapy. Invasive fungal infect ions - aspergi l los is - candidias is - cryptococcosis -ext r ins ic a l lergic a lveol i t is - immuno log i - cal d iagnos is - specif ic ant ibod ies - c irculat ing ant igens. 1, Introduction D ans le cadre du depistage des mycoses profondes ou des pneu- mopathies d'hypersensibilite, le diagnostic serologique est indis- pensable. Aspergilloses, candidoses et cryptococcoses sont les prin- cipales mycoses profondes observees en France. Nous n'aborderons pas le cas des mycoses tropicales. Ces affections s6v6res sont souvent fatales chez les patients immu- nodeprim6s, seropositifs au VlH, greffes de moelle, transplantes, ceux atteints d'hemopathies malignes, ou ceux sous chimiotherapie, cor- ticotherapie mais egalement chez les patients des services de soins intensifs et de r6animation. Le diagnostic s6rologique par la mise en 6vidence dans le serum d' anticorps specifiques ou d'antig6nes cir- culants contribue au diagnostic de ces mycoses. II peut dans certaines situations authentifier une mycose profonde, alors que I'agent patho- gene est difficile & isoler. Ce diagnostic exige des qualit6s de sensi- bilit6 et de sp6cificite excellentes pour un diagnostic precoce et une mise en traitement rapide. Les resultats de la s6rologie ne peuvent 6tre interpretes qu'apr6s confrontation du contexte clinique, du statut immu- nitaire, des th6rapeutiques instituees et des examens mycologiques r6alises chez ces patients. 2. Methodes de diagnostic serologique 2.1. Prelevements Chez les patients pour lesquels une serologie mycosique est pres- crite, la detection des anticorps et des antigenes solubles est rea- lis6e sur le s6rum. II est possible de rechercher des antigenes darts d'autres pr616vements : LCR, LBA et urines. Les echantillons doivent ~tre conserves & +4 C moins d'une semaine. IIs sent ensuite congel6s et conserves au moins un an & -30 C (arrete du 25/04/1 995). La frequence des pr616vements et les m6thodes de diagnostic & pra- tiquer sont fonction des pathologies et du statut immunitaire du patient. 2.2. Detection des anticorps 2.2.1. Antig~nes utilis~s Des antigenes solubles et figures sont utilises pour ce diagnostic. La majorite sont commercialises, mais certains sont encore prepares au Revue Frangaise des Laboratoires, octobre 2004, N 366 61 Analyses s#rologiques specifiques au cours de processus infectieux : inter~ts et limites laboratoire. Les antigenes somatiques proviennent du surnageant de broyats de myceliums ou de blastospores de cultures jeunes. Les anti- genes solubles metaboliques extra-cellulaires sont obtenus & partir de filtrats de cultures &gees de champignons en milieu liquide. 2.2,2. Techniques de d6tection des anticorps De nombreuses techniques sont utilisees dans le diagnostic immu- nologique des mycoses : techniques d'immunoprecipitation, immu- nofluorescence, methodes immunoenzymatiques, hemagglutination. Techniques d' imrnunoprbcipitat ion [9, 10] Ces methodes introduites pour le diagnostic des mycoses depuis plus de 30 ans sont toujours pratiquees. La technique d'Ouchterlony ou double diffusion en gelose (IDD), I'electrosynerese (ELS), I'immuno- electrophorese (IELP) et I'immunoempreinte lIE) permettent la detec- tion d'anticorps precipitants. La technique d'Ouchterlony est realisee sur des plaques de verre recou- vertes d'un gel d'agarose. Les antigenes et le serum, deposes dans des puits proches, diffusent dans la gelose pendant 24 & 48 h. La presence d'anticorps seriques se traduit par I'apparition d'un ou plusieurs arcs de precipitation situes dans la zone de gel separant les deux puits. Ces arcs sont visualises par une coloration du gel. Cette methode qualitative a comme inconvenient de foumir un resultat tardif (4 & 5 jours) et de plus exige une quantite importante d'antigenes. Ainsi, de nombreux laboratoires preferent utiliser I'electrosynerese (ES), ou immuno-electrodiffusion, methode qualitative, sensible et rapide effec- tuee en moins de 24 h. Elle consiste a faire migrer dans un champ elec- trique antigenes et anticorps, ce qui accelere la migration. Les anticorps charges negativement migrent vers la cathode et les antigenes vers I'anode. Une reaction positive se traduit par la detection d'un ou plusieurs arcs de precipitation. L'ES peut tre realise sur un gel d'agarose ou sur membrane d'acetate de cellulose. Lorsqu'un des deux tests, IDD ou ES est positif, une IELP ou une coelec- trosynerese (CoES) dolt etre realisee pour confirmer le resultat. L'IELP, technique de reference, combine I'electrophorese de la suspension anti- genique & une double diffusion dans la gelose des antigenes et des anti- corps. L'interpretation repose sur le nombre et la position des arcs de precipitation, leur forme et leur epaisseur. Elle est moins sensible que les methodes precedentes, mais specifique, car elle permet une ana- lyse qualitative et une Iocalisation des arcs de precipitation. Ainsi, un seul arc de precipitation en IDD peut se traduire en IELP par I'apparition de plusieurs arcs. L'IELP a comme inconvenient d'avoir un delai de reponse long. Une modification de la methodologie a ameliore ces performances. C'est I'im- munoelectrophorese rapide (IER). Les resultats sont obtenus dans les 24 h avec des performances identiques & I'IELR Cette methode appli- quee au diagnostic des parasitoses et des mycoses est pratiquee dans notre laboratoire depuis plus de 15 ans (reactif commercialise Paragon Beckman Coulter) [14, 18]. En introduisant un serum de reference, la coelectrosynerese permet de valider un test de depistage positif. Un arc est considere comme posi- tif si une identite entre les arcs du serum a. tester et du serum de refe- rence est revelee, ce qui se traduit par une continuite dans les arcs de precipitation. En ES, IDD ou IELP, les arcs sont visualises apres coloration par le Bleu de Commassie ou I'amido-Schwartz ou le violet acide. En CoES comme en I ELP, I'activite enzymatique d'un antigene peut 6tre raise en evidence en ajoutant le substrat adequat. La valeur et la qualite des reactions par precipitation cornpensent largement leur manque de sensibilit& D'autres techniques peuvent ~tre pratiqu~es pour ne depistage [11] [] L'immunofluorescence (IFI) est une de ces techniques, Pour le dia- gnostic des candidoses, les antigenes sont des blastospores obtenues 62 & partir d'une culture de Candida albicans fixes sur des lames. Dans le cas des aspergilloses, les lames sont preparees & partir de coupes & congelation d'organes d'animaux infestes (lapin) par Aspergillus fumi- gatus. Ces preparations sont conservees congelees & -20 C. [] La technique d'hemagglutination indirecte (HAGG) est basee sur l'utilisation d'hematies sensibilisees par des antigenes solubles. Elle est de realisation facile et rapide. [] Les techniques immunoenzymatiques (EIA) ont une meilleure sen- sibilite que les precedentes. Elles ont comme autre avantage d'etre quantitative, de lecture objective et automatisable. En cas de positivite d'un de ces tests ou de discordances entre eux, une technique de confirmation parmi les suivantes COES, IELP ou IE dolt 6tre pratiquee (arrete du 25/04/95). Techniques de d#.tection des antig~nes circutants Chez les patients profondement immunodeprimes, la mise en evidence d' anticorps seriques est souvent defaillante. La recherche d'antigenes solubles, circulants, relargues dans le sang, les urines, le LCR est dans cette situation plus adaptee. L'objectif est de depister precocement une mycose profonde, aspergillose, candidose ou cryptococcose. IIs peuvent etre recherches par des methodes immunoenzymatiques ou des tests d'agglutination de particules de latex. Les methodes immu- noenzymatiques, tres sensibles, permettent la detection d'antigenes circulants meme s'ils sent excretes en faible quantit& 3, Applications au diagnostic des mycoses 3.1. D iagnost ic sero log ique de la c ryptococcose La cryptococcose, infection opportuniste due & Cryptococcus neoformans survient generalement chez les patients atteints de sida, de lymphomes, de sarcdr'dose ou sous corticotherapie ou chez les transplantes d'organes. La primo-infection pulmonaire est le plus souvent asymptomatique. Elle est & I'origine de la dissemination du champignon dans I'organisme, en particulier au niveau du systeme nerveux central, & I'origine d'une meningo-encephalite subaigu~, forme clinique la plus frequente. La cryptococcose est observee chez les patients seropositif au VlH dont le nombre de lymphocytes T CD4 est inferieur a 100/mm 3 [4]. Le diagnostic serologique de la cryptococcose est un des elements du diagnostic. II repose sur la recherche d'un antigene soluble circulant polysaccharidique de Cryptoceccus neoformans. Au cours de I'infection, un relargage important d'antigenes capsulaires est observe. L'antigene est recherche dans le serum et dans d'autres liquides, LCR, plus rarement LBA ou urines. Plusieurs reactifs permettent la detection de cet antigene. Les techniques les plus utilisees sont des tests d'agglutination de particules de latex sensibilisees par des anticorps polyclonaux diriges contre les antigenes polysaccharidiques, Kit Crypto-LA test (Fumouze), Cryptococcal Antigen Detection System GALAS TM (Meridian Bioscience) et Latex- Crypto Antigen Detection System (Immy) ou par des anticorps monoclonaux, Pastorex Cryptococcus Plus (Biorad). Une technique immunoenzymatique en microplaque est 6galement disponible (Premier Cryptococcal antigen (Meridian Bioscience) [3]. Dans le cadre d'une cryptococcose neuromeningee, il est imperatif d'effectuer une recherche en parallele dans le serum et le LOR. Si le test de depistage est positif, il faut effectuer un titrage. La specificite de ces tests est bonne. La sensibilite est de plus de 95 % dans le serum et proche de 90 % dans le LCR [10]. Les tests au latex, faciles b. executer, d'une bonne sensibilite et specificite peuvent etre realises en urgence. IIs sont d'un grand apport dans le diagnostic de cette infection. IIs sont positifs tres Revue Frangaise des Laboratoires, octobre 2004, N 366 Analyses s#rologiques specifiques au cours de processus infectieux : int~r~ts et limites precocement, en particulier chez les patients atteints de sida. L'EIA a comme inconvenient d'etre difficile & realiser en urgence, alors qu'elle est utile Iorsqu'on traite un hombre important d'echantillons. La cinetique de I'antigenemie et de I'antigenorachie est & suivre. II faut effectuer un titrage en utilisant le meme reactif et le realiser dans la meme serie de tests. La diminution des titres indique une reponse positive & la therapeutique. En revanche, I'augmentation des titres temoigne d'une infection en evolution. La detection d'anticorps n'est pas pratiquee pour le diagnostic de cette infection. 3.2. Diagnostic serologique des candidoses systemiques Les infections dues & Candida sont au premier rang des infections nosocomiales fongiques [7]. Les candidoses systemiques sont de plus en plus frequentes et les facteurs favorisants leur survenue mieux definis. L'infection est Nee a la colonisation de differents organes par des levures du genre Candida qui sont habitueNement des commensaux chez les sujets sains. Jk partir de la colonisation, il peut y avoir dissemination dans tout I'organisme [16, 23]. L'infection peut avoir deux origines : soit endogene a partir d'un foyer digestif, I'antibiotherapie a dans ce cas une grande importance car elle induit une croissance de Candida dans le tube digestif, soit exogene a partir d'un acte therapeutique impliquant un traumatisme vasculaire, par exemple la pose de catheter. Chez les patients hospitalises dans les services de cancerologie, la granulocytopenie, consequence de la chimiotherapie, est le facteur de risque le plus important de survenue d'une candidose systemique. Dans les services de reanimation, ces infections surviennent chez des sujets immunodeprimes mais egalement immunocompetents, les facteurs de risque sont la pose de catheter, de sonde urinaire, I'hemodialyse. II en est de meme pour les patients de soins intensifs soumis & une antibiotherapie & large spectre. L'etude multicentrique menee en France dans 25 CHU et coordonnee par R. Grillot et al. a montre que, Iors de ta survenue d'une candidemie, 35 % des sujets etaient hospitalises en reanimation et que 88 % etaient porteurs de catheter [11]. Chez ces patients, le diagnostic biologique des candidoses systemiques se heurte & de nombreuses difficultes. Pour evaluer le risque d'une candidose systemique, en plus des donnees radiologiques et cliniques, les methodes serologiques sont un complement au diagnostic mycologique direct. La sensibilite des hemocultures pratiquees quotidiennement n'est que de 40 A 60 % [16]. Plusieurs methodes sont utilisees pour la mise en evidence des anticorps [4, 10]. Le depistage d'une candidose systemique doit associer deux techniques parmi les suivantes : ELS, HAGG, EIA, IFI. Si un des tests est positif, les tests de confirmation COES, IELP ou IE sont & realiser (arrete 25/04/95). L'immunofluorescence tres utilisee dans ce diagnostic est facile realiser et sensible. La lecture est le point delicat. Les techniques d'hemagglutination indirecte, utilisant des antigenes solubles de Candida sont simples a pratiquer et rapides. Les techniques d'immunoprecipitation sont d'interpretation difficile. Dans le cas de porteurs sains, un arc de precipitation est frequemment detect& La raise en evidence de trois arcs de precipitation en IELP ou COES peut etre le temoin d'une infection fongique. Un test immunoenzymatique a ete mis au point permettant la detection dans le serum d'anticorps antimannanes, antigenes preponderants de la paroi des levures [19]. Ce reactif standardise est commercialise (Biorad Platelia Candida Ac). La detection d'anticorps est un des criteres qui permet d'evaluer la pathogenie des infections a, Candid& Cependant, la presence d'anticorps anti-Candida chez les patient suspects de candidose systemique n'est pas d'interpretation facile du fait de leur presence chez des porteurs sains. Elle ne permet pas de differencier infection et co]onisation intense [16]. En pratique, le suivi serologique des patients & risque est necessaire au rythme minimum d'un examen par semaine. L'EIA est A preconiser car c'est une methode sensible et quantitative. Une seroconversion ou une elevation significative du titre des anticorps sur deux prel~vements successifs sont un argument en faveur d'une colonisation par les levures, phase precedant I'infection. II faut alors effectuer des recherches mycologiques & differents niveaux. Si la recherche d'anticorps est negative avant I'induction d'une immunodepression, par exemple Iors d'un bilan pre-greffe, les resultats des serologies ulterieures seront plus faciles & interpreter. Chez les patients & risque susceptibles de developper une candidose, il est egalement possible de suivre I'antigenemie. Un deuxi~me test immunoenzymatique commercialise a ete mis au point qui permet la recherche de I'antigene mannane avec une sensibilite de 0, 1 ng/mL (Biorad Platelia Candida Ag ) Les deux tests immunoenzymatiques, recherche de I'antigene et des anticorps peuvent etre associes et les resultats sent encourageants. La sensibilite et la specificite de ces deux tests est respectivement de 80 % et 93 % chez des patients infectes par Candida [19]. Au cours de l'infection, les patients atteints de candidoses systemiques presentent soit une antigenemie elevee en I'absence d'anticorps soit des taux significatifs d'anticorps et une antigenemie negative. Dans la majorite des cas, l'antigenemie precede la production d'anticorps. La sensibilite combinee de ces deux tests est de plus de 80 % pour les infections determinees par Candida albicans, Candida glabrata et Candida tropicalis, especes isolees dans plus de 90 % des candidoses nosocomiales et la specificite de plus de 90 %. Dans plus de 73 % des cas, le diagnostic de candidose systemique a ete pose avant que la premiere hemoculture ne soit positive. ,&, la suite de cette etude, les auteurs preconisent une surveillance serologique deux fois par semaine associant antigenemie et detection des anticorps pour un depistage precoce de I'infection [16, 24]. Un test d'agglutination de particules de latex sensibilisees par un anticorps monoclonal anti-mannane permet la detection d'antigenes circulants. Ce test d'une bonne specificite mais de sensibilite mediocre (30 %) est peu utilise [3, 11]. 3.3. Diagnostic serologique des aspergiNoses Les aspergilloses sont des affections le plus souvent pulmonaires. Aspergillus fumigatus est responsable de la majorite des infections humaines. Le diagnostic immunologique est essentiel dans cette pathologie pulmonaire, soit par mise en evidence d'anticorps precipitants chez le sujet immunocompetent (aspergillose, alveolite allergique extrinseque...), d'lgE dans le cas de I'asthme aspergillaire ou par la recherche d'antig~nes circulants chez le patient immunodeprime. Mais il ne peut etre etabli qu'apres confrontation des arguments cNniques, radiologiques et microbiologiques (tableaux Ie t II). Plusieurs formes cliniques sont observees dans les aspergilloses de I'appareil respiratoire et le diagnostic varie en fonction de celles-ci [4, 18]. [] L'aspergillome correspond au developpement du champignon dans une cavite broncho-pulmonaire ou pleurale preexistante (par exemple une ancienne caverne tuberculeuse). Les spores d'Aspergillus penetrent par vole aerienne. [] Les surinfections aspergillaires sent observees chez les sujets atteints de broncho-pneumopathies obstructives chroniques (bron- chite chronique, asthme, mucoviscidose...). l [ La bronchite aspergillaire est observee tres rarement. Revue Fran?aise des Laboratoires, octobre 2004, N 366 63 Analyses serologiques specifiques au cours de processus infectieux : inter#ts et I/mites (pu mona re surtout) de moe e s da stade, tres evolue, voire terminal. , WaspergHIose invasive correspond au developpement de fila- ments d'Aspergillus dans le parenchyme pulmonaire chez des patients profondement immunodeprimes. Le diagnostic dolt etre pre- coce. II est urgent car I'evolution est, dans la majorite des cas, mor- telle en I'absence de traitement. Le diagnostic de certitude est tres difficile & etablir. Chez les patients d'hematologie, les facteurs de risque identifies sont I'intensit~ et la dur~e de la neutropenie (nombre inf~rieur & 500/ram 3 pendant une per/ode superieure & 10 jours), la corticotherapie (au-dessus de 1 mg/kg/j), les antecedents d'as- pergillose ou la contamination des voles aeriennes par Aspergillus anterieurement & la neutropenie et I'allogreffe de cellules souches hematopdi'~tiques. Concernant les transplantations d'organe, le risque le plus elev6 concerne les transplantations pulmonaires. Le risque est en relation avec I'intensite de I'immunodepression [2, 4, 5]. m Asper~gifloses allergiques. Dans ce cas, le champignon se com- porte comme un allergene, II faut distinguer : - I'alv~olite allergique extrinseque due & I'Aspergiflus, affection de meme nature que le poumon de fermier. Le diagnostic consiste & 64 mettre en evidence des anticorps precipitants. On ne detecte pas d'lgE specifiques ; - I'asthrne aspergillaire, relativement rare, lie & I'inhalation de spores d'Aspergillus sur un terrain atopique. II n'existe pas d'infection pulmonaire. La reponse immunologique est de type immediat. Le diagnostic immunologique repose sur la detection d'lgE specifiques. On ne detecte pas de precipitines ; -I'aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA) ou maladie de Hinson associe deux types d'hypersensibilite, immediate avec presence d'anticorps IgE et semi-retardee avec des anticorps precipitants anti-aspergillaires avec un nombre d'arcs variables (de 2 & 9). Elle est observee au cours de la mucoviscidose [1]. Les methodes serologiques utilis6es darts le diagnostic des aspergilloses pulmonaires varient en fonction des forrnes cliniques. - Mise en evidence d'anticorps darts le s~rum. C'est la recherche & preconiser pour le diagnostic de la majorite des formes cliniques sauf Revue Fran?aise des Laboratoires, octobre 2004, N 366 Analyses serologiques sp#cifiques au cours de processus infectieux : int#r#ts et limites en cas d'immunod6pression tres severe. Les Aspergillus sont tres immunogenes. -Les techniques d' immunopr~cipitat ion, les plus utilisees pour le diagnostic de I'aspergillose chez le sujet immunocompetent sent les methodes de reference [4, 9, 10, 18]. En revanche, chez ]'immu- nodeprime, la recherche de precipitines est souvent negative ou de positMte trop tardive (tableaux / et //). Les antigenes somatiques et metaboliques d'Aspergi//us furnigatus, ainsi que les antigenes metaboliques d'Aspergi//us flavus, nidu/ans, terreus et niger sent commercialis6s et peuvent etre testes par lea techniques d' immunodiffusion (Biorad antigenes Aspergi//us). La double diffusion en gelose ou I'electrosyn6rese si elles revelent des arcs de precipitation sent confirmees par I'IELP ou la COES. La presence d'arcs de precipitation en IELP ou COES doit 6tre completee par la revelation d'arcs & support d'activites enzymatiques, catalasique (fraction J) et/ou chymotrypsique (fraction C). II est extremement facile de reveler I'activite catalasique. L'immuno- electrophorese eat une methode Iongue (4 jours). La technique modifiee, immunoelectrophor~se rapide (IER) permet la lecture en 24 h (figure 1). En IELP, la presence de trois arcs de precipitation centre un antigene d'Aspergi//us est en faveur d'une aspergi[Iose evolutive. Lors de reactions faiblement positives (1 & 2 arcs), I'identification d' une activite enzymatique catalasique ou/et chymotrypsique permet de porter le diagnostic d'infection aspergillaire. Dans les aspergillomes, les reactions sent generalement tres positives. Cinq & dix arcs sent frequemment observes avec presence d'une actMte enzymatique. Le nombre d'arcs de precipitation decroTt lentement apres un traitement. L'IELP et I'IER ont une specificite et une reproductibilite excellentes. La mise en evidence d'anticorps precipitants permet le diagnostic de I'aspergillome dans plus de 90 % des cas. En cas de suspicion d'alveolite allergique extrinseque, la detection d'anticorps precipitants est essentielle. De meme, le diagnostic biologique d'aspergillose broncho-pulmonaire allergique est 6tabli par la detection d'lgE specifiques et d'anticorps precipitants. D'autres techniques sent pratiquees pour le depistage des anticorps, mais doivent 6tre confirmees par une technique d'immunopr~cipitation si elles sent positives [4, 9, 10]. - L'immunofluorescence, methode sensible et specifique, est realisee avec des antigenes obtenus & partir de coupes & congelation d'organes d'animaux infestes (lapin) par Aspergillus fumigatus. Ces reactifs ne sent pas commercialises, ce qui en limite la diffusion. - Les methodes immunoenzymatiques pratiquees par certaines equipes sent encore & evaluer. Du fair de leur sensibilite, elles detectent des anticorps chez des sujets sains [13]. -La reaction d'hemagglutination est d'execution facile et rapide. Elle permet le depistage des aspergilloses evolutives si les titres sent superieurs & 1/160. Mais cette reaction manque de specificit& Recherche d'antigenes circulants aspergillaires Le diagnostic de raspergillose invasive est etabli sur un ensemble de criteres, cliniques, radiologiques, mycologiques dent la recherche du champignon dans les expectorations, LBA, aspiration tracheale ou biopsie pulmonaire et la recherche d'antigenes circulants [2]. La detection d'antigenes est essentielle pour le diagnostic precoce d'aspergillose invasive chez les patients neutrepeniques ou sous traitement immunosuppresseur prolong& Les antigenes sent secretes pendant la phase de croissance et de lyse des Aspergi//us dans les tissus. IIs peuvent etre detectes dans les liquides biologiques, serum, urine, LBA. Antigene somatique Aspergillus fumigatus Serun du patie (concentre Arcs specifiques Antigene metabolique Aspergillua fumigatus Immuno61ectrophorese rapide - Coffret Beckman Paragon, coloration des gels Coomassie violet. Antigenes Biorad. Antigene Micrepolyspora faeni Serum du patient non concentre Arcs ~.cifiques Immunoelectrophor~se rapide - Coffret Beckman Paragon, coloration des gels Coomassle violet. Ag : dejections de pigeons Arcs specifiques Serum du patient non concentre Ag : s~rum de pigeon Immunoelectrophorese rapide - Coffret Beckman Paragon, coloration des gels Coomaseie violet. Revue Franq;aise des Laboratoires, octobre 2004, N 366 65 Analyses s~rologiques specifiques au cours de processus infectieux : inter~ts et limites Les galactomannanes sent un des composants des parois cellulaires des Aspergillus et d'autres moisissures. IIs resistent & Faction des enzymes et & I'ebullition. La detection de I'antigene galactomanne peut etre r6alisee par deux rnethodes. Un test immunoenzyrnafique permet la detection d'antigenes & I'aide d'un anticorps monoclonal antigalactomannane. (reactif Platelia Aspergiflus). L'anticorps monoclenal est utilise pour sensibiliser les puits de la microplaque et capter I'antigene mais egalement comme detecteur (anticorps marque & la peroxydase). La limite de detection est de 1 ng/mL [13]. Ce test a comme interet d'etre de reponse tres precoce, mais il peut difficilement etre realise en urgence. Dans les cas o~ un prelevement se revele positif, il est imperatif de confirmer la positivite sur un neuvel echantillon et de ]es tester dans la meme serie de tests. Deux prelevements successifs positifs sent le temoin de la presence de galactomannane dans le serum. Ces resultats positifs doivent etre confrontes aux donnees biocliniques avant de conclure & une aspergillose invasive et d'instituer un traitement. La sensibilite de cette methode varie de 60 & 100 % suivant les auteurs [2, 12, 15, 20]. Le probleme de ce test est la specificite [15, 21 ]. ,/k I'origine des nombreux faux positifs observes, I'absorption par les patients en particulier les enfants de galactomannane presents dans de nombreux aliments contamines par des Aspergillus ou des Penicillium. Des faux positifs sent egalement decrits en relation avec un traitement par des antibiotiques ~-Iactamines semi-synthetiques, en particulier I'association piperaciliine-tazobactam (Tazocilline). Ces antibiotiques sent issus de cultures de moisissures du genre Penicilliurn. La presence de galactomannane a ate demontree dans les precurseurs de la piperacilline issus de la fermentation du Penicillium, mais pas dans le tazobactam. Lors de I'interpretation du test, les traitements par ces antibiotiques doivent etre pris en compte. ,&, I'arret du traitement, le test se negative en un & six jours [21 ]. Chez les patients & risque, il est recommande de prelever un serum dos Ie debut de I'hospitalisation. Ce test dolt faire partie du suivi prospectif de ces patients au rythme de deux examens par semaine [20]. tl est egalement possible de detecter I'antigene galactomannane dans le serum par une technique d'agglutination. Ce test fair appel & I'agglutination de particules de latex recouvertes d'un anticorps monoclonal reconnaissant specifiquement le galactomannane. La reaction apres dissociation des immuns complexes met en contact le liquide biologique suppose contenir I'antigene etles billes de latex. Une reaction positive se traduit par une agglutination en quelques minutes des particules de latex. La limite de detection de ce test est de 15 ng/mL, soit 10 fois moins sensible que le test EIA [2, 3]. Cette technique plus ancienne est nettement moins sensible, mais peut etre realisee en urgence, ce qui est difficilement realisable avec le test EIA. Les recherches d'ADN aspergillaire et de l'antigene galactomannane dans le serum peuvent etre associees, la PCR etant plus specifique. La sensibilite des deux rnethodes est respectivement de 45 % et 52 %. La PCR n'a pas une meilleure sensibilite, mais leur association ameliore les criteres de diagnostic d'aspergillose invasive [6]. La recherche d'anticorps seriques est indispensable dos que I'immunite est restauree. EIle dolt etre associee & la detection d'antigenes circulants, I'antigenemie pouvant alors etre negative et la recherche d' anticorps positive. La presence d'anticorps semble un facteur de ben pronostic. Le delai d'apparition des anticorps est variable avec un delai de un #. six jours avant la sortie d'aplasie. En revanche, la presence persistante d'antigenes est un facteur de mauvais pronostic [8]. 4. Diagnostic des aiveolites allergiques extrinsbques (AAE) ou pneumopathies d'hypersensibilite [4, lo, 17] Les pneumopathies d'hypersensibilite sent de mecanisme immunoallergique complexe et peuvent evoluer vers une insuffisance respiratoire chronique. Elias resultent de I'inhalation chronique d'antigenes provenant de microorganismes bacteriens (actinomycetes thermophiles), fongiques (moisissures atmospheriques) mais egalement de proteines animales et de substances chimiques. Cene sent pas des mycoses, mais les agents declenchant I'hypersensibilite peuvent etre des champignons. De ce fait, le diagnostic est souvent realis6 dans les laboratoires de microbiologie. En France, les deux affections les rnieux decrites sent la maladie du poumon de fermier et la maladie du poumon des leveurs d'oiseaux. Pour la maladie du poumon de fermier, le reservoir antigenique est le foin, les fourrages, les substances vegetales moisies. La maladie est due & I'inhalation de spores presentes dans ces reservoirs. II s'agit de spores d'Aspergillus sp. ou d'Actinomycetes thermophiles, bacteries filamenteuses Iongtemps assimilees & des champignons. Ces especes sent nombreuses, Micropolyspora faeni, Thermoactinomyces vulgaris, Thermomonospora viridis, Thermopolyspora glauca, Thermopolyspora polyspora, Therrnoactinomyces curvata. La tres petite taille des spores leur permet d'acceder aux alveoles pulmonaires. La maladie du poumon des eleveurs d'oiseaux est due & une sensibilisation & des proteines aviaires, le reservoir antigenique etant constitue par les dejections etles serums d'oiseaux (pigeons, poules, canards, perruches...). Le diagnostic biologique de ces affections est immunologique. Un des criteres de diagnostic est la mise en evidence de precipitines seriques, anticorps de la classe des IgG, temoin d'une exposition antigenique. De nombreux antigenes sent prepares au sein du laboratoire. D'autres sent commercialises : antigenes d'Aspergillus (Biorad), antigenes pour le diagnostic du poumon des eleveurs d'oiseaux, serum de pigeons, de volailles, de perruches et fientes de pigeons et de perruches, ainsi que Micropelyspora faeni pour la serologie du poumon de fermier (Microgen Bioproducts-UK). Les antigenes confectionnes artisanalement dans les laboratoires le sent selon des precedes variables [10, 17]. IIs sent de plusieurs types soit prepares & partir de substances vegetales ou animales, soit & partir de culture d'Actinomycetes ou de champignons. Ces extraits sent des mosa)"ques antigeniques. IIs ne sent pas standardises et leur qualite peut varier d'un laboratoire & un autre. Pour le diagnostic de ces affections, il est conseille de tester un panel d'antigenes dent ceux de ]a region du patient. En pratique quotidienne, dans le laboratoire, les antigenes decrits precedemment (actinomycetes thermophiles, antigenes aspergillaires et antigenes aviaires) sent testes systematiquement. Le depistage est realise sur le serum concentre par la methode d'Ouchterlony, ce qui permet le criblage d'un grand hombre d'antigenes. L'electrosynerese est une autre methode utilisee pour le depistage de ces infections. Si un ou plusieurs arcs de precipitation sent reveles par ces tests, un test de confirmation est pratique soit I'immunoelectrophorese (figures 2 et 3) soit la COES avec des resultats comparabies [17, 22]. Les resultats sent & interpreter en fonction du contexte clinique et epidemiologique. Le diagnostic de ces affections repose sur plusieurs criteres. Les signes cliniques etles examens paracliniques sent essentiels en particulier I'aspect radiologique pulmonaire. II faut egalement faire la preuve d'une exposition antigenique et detecter des anticorps precipitants vis-&-vis de ces antigenes. La presence d'anticorps est le temoin d'un contact antigenique mais ne permet pas de differencier le simple contact d'une infection evolutive. En effet, il 66 Revue Frangaise des Laboratoires, octobre 2004, N D 366 Analyses s#rologiques sp~cifiques au cours de processus infectieux : inter#ts et fimites est frequent d'observer la presence d'anticorps chez des sujets exposes mais non malades. L'absence d'anticorps n'exclut pas une alveolite. Ces faux negatifs peuvent 6tre dus au choix de I'antigene teste (nombreux antigenes) ou & des problemes techniques (rapport antigene-anticorps). Si le contexte clinique, radiologique et epidemiologique est tres evocateur d'une AAE et la serologie negative, il peut 6tre necessaire de preparer des antigenes ,, personnalises ,, & partir des sources antigeniques auxquelles le patient est expose, Pour le diagnostic d'autres pneumopathies d'hypersensibil ite (maladie des champignonnistes, des fromagers...), les antig~nes & utiliser sent differents selon rAAE [4, 10, 17]. 5. Conclusion L e diagnost ic immunologique contdbue au diagnostic des mycoses profendes. II permet dans certains cas un diagnostic pre- coce et une raise en traitement rapide, en particulier Iorsque I'agent pathogene est difficilement mis en evidence. Cela impose un suivi sero- Iogique regulier des patients & risque. Ce diagnostic a beneficie de I'apport des methodes immunoenzymatiques qui permet la detection des anticorps, mais egalement des antigenes circulants. La frequence des examens et les methodes & preconiser varient en fenction des pathologies. R f rences [1] Br~mont E, Reoco P., Linas M.D., Seguela J.P., Dutau G. Mycoses bronchopulmonaires et muco- viec dose. Rev. Fr. Lab. 249 (1993) 115-118. [2] Bretagne S., Les infections fongiques pulmo- naires chez le patient neutropenique. Le point de rue du mycologue, Infections fongiques pulmonaires, JIDIF, Optimed Ed.. 2001, pp. 91-104. [3] Brun S., Bouchara J.R, Chabasse D., Diagnostic au laboratoire des mycoses profonde& Rev. Fr. Lab. 359 (2004) 33-38. [4] Chabasse D. Guiguen C., Contet-Audonneau N.~ Mycologie medicale, coil. Abreges, Masson, Paris, 1999. [5] Conference ae consensus ANAES, Prevention du risque aspergiltaire chez les patients immunod~- primes (H~matologie, Transplantation), Experts : Bretagne S. Cordonnier C., Cornet M. 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