Intérêt de l'analyse en cytométrie en flux des sous-populations lymphocytaires chez les patients infectés par le VIH

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    03-Jul-2016

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  • nt@r@t de l'analyse en cytom@trie en flux des sous-populations lymphocytaires chez les patients infect@s par le VIH

    G. CARCELAIN, C. BLANC, P. DEBRE, et B. AUTRAN *

    R~:SUM~: SUMMARY

    Les anomalies observ~es au cours de l'infection ~ VIII sont domin~es par un d~ficit ~ la fois quantitatif et quali- tatif des lymphocytes T CD4+, cible principale du virus. Chez la plupart des patients s~ropositifs, la valeur abso- lue et le pourcentage de lymphocytes T CD4+ diminuent progressivement au cours du temps. Ces valeurs sont d~tect~es par immunofluorescence directe avec adjonction de billes fluorescentes pour obte- nir simultan~ment des valeurs absolues. Ce marqueur, associ~ ~ la mesure de la vir~mie VIH, reste le crit~re le plus utilis~ pour ce qui concerne les indications th~rapeu- tiques ou les ajustements individuels de traiternent anti- r~troviral. Actuellement de nombreuses ~tudes encore pr~liminaires montrent que des r~sultats nettement sup~rieurs sont obtenus avec des associations d'anti-r~troviraux par rap- port aux monoth~rapies. Ces associations induisent une baisse de la charge virale et une augmentation des cel- lules T CD4 beaucoup plus importantes et plus stables. Ce marqueur du d~ficit immunitaire reste d'actualit~ et il est donc actuellement urgent d'en r~valuer la valeur pro- nostique sous ces nouveaux traitements .

    MOTS-CLI:S

    cytom~trie en flux -sous-populations lymphocytaires - VIH - quadruple marquage - valeur absolue.

    Abnormalities observed during HIV course are dominated by a quantitatif and qualitatif deficit of the CD4+ T cells, major target of the virus. HIV-infected patients show a progressive depletion of their CD4+ T lymphocytes. This can be objected by indirect immunofluorescence analysis and adjonction of fluorescent beads to obtain cell count. This marker, associate with virus load measu- rement, is still use as clinical outcome of therapeutic stu- dies. Actually it seems that associations of ART are better than treatments with only one molecule. Such associations induce a significantly increase of CD4 lymphocytes counts and a reduction of plasma viral RNA with greatest magnitude and duration.

    KEY-WORDS

    flow cytometry - T lymphocyte subsets - H IV - quadruple color analysis - lymphocyte number.

    Introduction

    Un d~ficit progressif de l'immunit~ cellulaire caract~- rise l'ensemble des anomalies immunologiques obser- v~es au cours de l'infection ~ VIH (18). Le VIH para- site le syst~me immunitaire en utilisant ~ son propre compte diverses molecules de ce syst~me. La s~lecti- vit~ du tropisme cellulaire du VIH et la s~v~rit~ du d~ficit immunitaire induit par l'infection sont en grande partie li~es ~ l'interaction sp~cifique entre la glycoprot~ine d'enveloppe du VIH, la gp120 et la molecule CD4 r~cepteur de haute affinit~ au VIH. Les anomalies sont domin~es par un d~ficit ~ la fois quan- titatif et qualitatif des lymphocytes T CD4+, cible principale de l'infection par le VIH.

    De nombreux param~tres immunologiques du d~ficit immunitaire ont ~t~ proposes. Parmi eux, la numera- tion des lymphocytes T CD4+ est devenue le crit~re universellement adopt~ du d~ficit immunitaire et a ~t~ introduite dans ia classification du CDC. Les patients sont ainsi habituellement classes en trois groupes selon qu'ils ont moins de 200 lymphocytes T CD4+, entre 200 et 500, ou plus de 500/mm 3 (4).

    * Laboratoire d'irnrnunologie cellulaire et tissulaire Groupe hospitalier Piti~-Salp~tri~re 47-83, bd de l'H6pital 75651 PARIS CEDEX 13

    TIRES A PART Nlme le Pr B. AUTRAN

    article regu ie 2 ao~t, accept~ le 20 septembre 1996.

    Revue frangaise des laboratoires, octobre 1996, N 287 53

  • I. La sous-population CD4 significative. La g~n~ralisation des m~thodes de lyse sans centrifugation rend cependant n~cessaire l'introduction du CD45 et du CD3 pour une meilleure d~finition de la popula- tion sous-lymphocytaire CD4.

    1. La population lymphocytaire T CD4+ et son int6r~t

    Les lymphocytes T matures se r@artissent en deux popula- tions principales, fonctionnellement distinctes, qui expriment soit la mol~cule CD4, soit la mol~cule CD8. La mol~cule CD4 est exprim~e ~ la membrane de 42 % (38- 46 %) des lymphocytes T p~riph~riques, soit 800 cellules T CD4+/mm 3 ( 700-1100/mm 3) (15). II s'agit d'une mol~cule de poids mol~culaire de 55 kilodalton, compos~e de quatre domaines extracellulaires de structure analogue & ceux des immunoglobulines. Cette mol~cule correspond au r~cepteur du VIH. Celui-ci s'y fixe par le biais de sa glycoprot&ine d'enveloppe gp120 ( 11, 20). Les cellules T CD4+, nomm~es CD4 auxilliaires, ont pour fonction essentielle d'initier et de r~guler l'activation et la fonction effectrice d'autres cellules (par exemple la production d'anticorps par les cellules B) par l'interm~diaire de cytokines. Leur fonction effectrice proprement dite est moins bien connue.

    La lymphop~nie CD4 est caract&ristique de l'infection ~ VIH mais elle n'est pas sp&cifique de cette infection. Le nombre de lymphocytes T CD4+ d'un sujet infect& fait partie des mar- queurs de routine utilis~s dans la surveillance immunologique des patients VIH+ (21, 27). II est bien corr~l~ ~ l'intensit~ du d~ficit immunitaire et aux stades cliniques de la maladie (24). II est utilis~ pour les indications de traitement anti-r~troviral et comme marqueur d'efficacit~ th~rapeutique (5) et il fait ~gale- ment partie des marqueurs pronostiques de l'infection ~ VIH bien que cette valeur pronostique soit controvers~e (31). La d~termination de l'intensit~ de la lymphop~nie CD4 permet de pr~dire la survenue d'infections opportunistes, d'instituer des traitements pr~ventifs et constitue une aide au diagnostic des complications opportunistes. Le marqueur CD4 reste actuellement toujours le marqueur de r~f~rence du d&ficit immunitaire induit par le virus bien qu'il ne puisse remplacer la mesure des param&tres virologiques (35). II est suivi tousles 4 mois 8 6 mois pour les sujets non trait~s ayant plus de 500 CD4/mm 3 et tousles 1 ~ 3 mois pour ceux ayant moins de 350 CD4/mm ~. Avant toute d~cision th~rapeutique, la valeur de ce marqueur est souvent mesur~e & un mois d'intervalle afin de v~rifier sa stabilit6 (14).

    2. Technique d'analyse des lymphocytes T CD4+ en cytom6trie en flux

    Ce typage lymphocytaire dolt comprendre au minimum l'ana- lyse des sous-populations T CD4+ et CD8+, en pourcentage et en valeur absolue par rapport aux lymphocytes totaux. Classiquement, cet examen est r~alis~ par un marquage en double couleur en immunofluorescence directe ou indirecte de cellules isol~es apr~s centrifugation du sang sur un gradient de Ficoll et lecture par cytom~trie en flux en analysant une popu- lation lymphocytaire d~finie par les param~tres taille (FSC) et structure (SSC). La technique s'est progressivement simplifi~e puisqu'elle est maintenant r~alis~e sur sang total avec lyse des h~maties suivie ou non d'un lavage. La d~termination du taux de CD4 doit ~tre r~alis~e dans un d~lai de 24 heures apr~s le pr~l~vement. Le CDC recommande actuellement un typage plus complet avec la d~termination simultan~e des marqueurs CD4+ CD8+ CD3+ CD45+ CD14+ CD19+ CD16+56+, par immunofluorescence directe, sur sang total avec lyse des h~maties et lavage. La lecture en cytom~trie en flux est alors faite sur une population lymphocytaire d~finie par la struc- ture (SSC) et le marqueur leucocytaire CD45+ et/ou par la somme des marqueurs lymphocytaires. Les marqueurs CD14, CD19 et CD16+56 reconnaissent respectivement les monocytes, les lymphocytes B et les cellules NK et permet- tent une analyse plus complete et donc plus s~re des sous- populations. N~anmoins la multiplicit~ de ces marqueurs n'am~liore pas la qualit~ de la numeration CD4 de fa~on

    3. D6termination de la valeur absolue

    Plusieurs m~thodes sont actuellement utilisables pour d~termi- ner ~ partir du pourcentage la valeur absolue correspondante. -Une numeration formule sanguine peut ~tre faite en paral- l&le sur compteurs de cellules automatiques et les valeurs abso- lues de CD4 ou de CD8 calcul~es ~ partir du nombre de lym- phocytes ainsi d~termin& - Le cytom~tre en flux peut &tre calibr~ en volume. Les pr~pa- rations sont analys~es pendant un temps fixe (d~termin& Iors d'une calibration du cytom&tre & l'aide d'un sang dont on conna~t la numeration des lymphocytes en valeur absolue). On suppose que le m~me volume de pr&paration est ensuite ana- lys~ sur chaque ~chantillon. -Enfin, ces valeurs peuvent &ire directement d&termin&es simultan~ment ~ l'analyse ph~notypique par l'adjonction & la preparation d'un ~talon interne qui consiste en des billes fluo- rescentes de concentration connue. Un volume de billes fluo- rescentes identique au volume de sang utilis~ pour le mar- quage est m~lang~ ~ la preparation. Pendant l'analyse, ces billes sont compt&es en m&me temps que les cellules de l'&chantillon. Puisque la valeur absolue des billes est connue et que les volumes de bille et de sang dans la preparation sont les m@mes, le nombre de cellules en valeur absolue peut @tre calcul~ automatiquement par le cytom~tre. Au total, on peut disposer ~ l'heure actuelle d'une analyse tr~s automatis~e : sur un seul tube, on r~alise une immunofluores- cence directe comportant les marqueurs CD4+ CD8+ CD3+ CD45+ et des billes permettent d'obtenir simultan~ment les valeurs absolues, la lecture est r~alis~e sur un cytom~tre quatre couleurs (un ou deux lasers) ~ l'aide d'un Iogiciel semi- fig~.

    4. La variabilit6 du comptage

    II faut tout d'abord garder ~ l'esprit la notion de l'existence de fluctuations pathologiques, des lymphocytes totaux et des lym- phocytes CD4, mais non sp~cifiques de l'infection ~ VIH (infections intercurrentes, immunosuppresseurs...). De plus, il a ~t~ mis en ~vidence une variabilit~ dans la repro- duction inter-laboratoires de la d~termination du param~tre CD4 (un coefficient de variabilit~ inter-laboratoires de |'ordre de 15 % a &t~ trouv~ dans l'~tude de ABOULKER et col.) (1, 30). Ainsi il est clairement ~vident que la variabilit& inter-labo- ratoires du comptage des cel|ules T CD4+ peut perturber des d~cisions concernant une &ventuelle mise sous traitement ou un classement en stade de la maladie VIH. II convient donc mieux de se baser non pas sur un r~sultat donn~ mais sur la tendance ressortant de plusieurs comptages, le tout replac~ dans un contexte plus large clinique et biologique. Ces ~l&- ments soulignent la n~cessit~ de contr61es de qualit~ fr~- quents.

    2. Les anomalies quantitatives observ6es au cours des diff6rentes phases

    de l'infection VIH

    1. La lymphop6nie CD4

    La lymphop~nie CD4+ permanente et progressivement crois- sante constitue le stigmate essentiel de l'infection ~ VIH. Elle conduit en moyenne en 10 ans depuis la primo-infection une d@l~tion absolue en lymphocytes T CD4+. Les m~ca- nismes exacts de cette d@l~tion restent cependant mal connus, probablement multifactoriels et controvers~s (24).

    54 Revue frangaise des laboratoires, octobre 1996, N 287

  • Cette d@letion T CD4+ est correlee
  • 3. Les marqueurs pronostiques

    1. Le d~ficit CD4, marqueur de progress ion du d~ficit immuni ta i re ?

    La valeur predictive de la lymphopenie T CD4+ a ete large- ment demontree parmi differents autres marqueurs et & titre individuel (9, 28, 32). Cette valeur pronostique est cependant limitee et ne permet de predire que la survenue d'infections opportunistes ; 50 % des sujets sans prophylaxie ayant moins de 200 lymphocytes CD4+/mm 3 ont un risque eleve d'appari- tion d'une pneumonie & Pneurnocystis carinii dans les 6 mois. Un taux de lymphocytes T CD4< ou egal & 200/mm 3 est ainsi une indication reconnue aux traitements anti-retrovi- raux et & la prevention des infections opportunistes. II devient cependant de plus en plus frequent de debuter ces traitements en dessous de 350 lymphocytes T CD4+/mm 3. La lymphope- nie CD4 profonde (

  • BIBL IOGRAPHIE

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