Dott.ssa Silvia Pellegrini Laboratorio Biologia Molecolare Dipartimento di Patologia Chirurgica, Medica e Molecolare e dell'Area Critica Tel. 050 2211251.

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    02-May-2015

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  • Dott.ssa Silvia Pellegrini Laboratorio Biologia Molecolare Dipartimento di Patologia Chirurgica, Medica e Molecolare e dell'Area Critica Tel. 050 2211251 e-mail: silvia.pellegrini@med.unipi.it
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  • Le scienze della vita sono attualmente al centro di una vera e propria rivoluzione
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  • Progetto Genoma Umano 1990 2003
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  • Genoma Linsieme di tutte le molecole di DNA presenti nel nucleo di ogni cellula Nelluomo: 44 cromosomi autosomici 2 cromosomi sessuali
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  • Struttura del DNA
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  • nucleo cromosoma Doppia elica istoni Coppie di basi cellula
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  • 1 ccctgtggag ccacacccta gggttggcca atctactccc aggagcaggg agggcaggag 61 ccagggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac 121 aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac accatggtgc acctgactcc tgaggagaag 181 tctgccgtta ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg 241 ggcaggttgg tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt 301 ggagacagag aagactcttg ggtttctgat aggcactgac tctctctgcc tattggtcta 361 ttttcccacc cttaggctgc tggtggtcta cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt 421 tggggatctg tccactcctg atgctgttat gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa 481 gaaagtgctc ggtgccttta gtgatggcct ggctcacctg gacaacctca agggcacctt 541 tgccacactg agtgagctgc actgtgacaa gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt 601 gagtctatgg gacccttgat gttttctttc cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca 661 taggaagggg agaagtaaca gggtacagtt tagaatggga aacagacgaa tgattgcatc 721 agtgtggaag tctcaggatc gttttagttt cttttatttg ctgttcataa caattgtttt 781 cttttgttta attcttgctt tctttttttt tcttctccgc aatttttact attatactta 841 atgccttaac attgtgtata acaaaaggaa atatctctga gatacattaa gtaacttaaa 901 aaaaaacttt acacagtctg cctagtacat tactatttgg aatatatgtg tgcttatttg 961 catattcata atctccctac tttattttct tttattttta attgatacat aatcattata 1021 catatttatg ggttaaagtg taatgtttta atatgtgtac acatattgac caaatcaggg 1081 taattttgca tttgtaattt taaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat 1141 cttatttcta atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca 1201 tgcctctttg caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa 1261 tatttctgca tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt 1321 gctaatagca gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct 1381 ggattattct gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc 1441 tcccacagct cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat 1501 tcaccccacc agtgcaggct gcctatcaga aagtggtggc tggtgtggct aatgccctgg 1561 cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt 1621 tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct 1681 gcctaataaa aaacatttat tttcattgca atgatgtatt taaattattt ctgaatattt 1741 tactaaaaag ggaatgtggg aggtcagtgc atttaaaaca taaagaaatg atgagctgtt 1801 caaaccttgg gaaaatacac tatatcttaa actccatgaa agaaggtgag gctgcaacca 1861 gctaatgcac attggcaaca gcccctgatg cctatgcctt attcatccct cagaaaagga 1921 ttcttgtaga ggcttgattt gcaggttaaa gttttgctat gctgtatttt acattactta 1981 ttgttttagc tgtcctcatg aatgtctttt cactacccat ttgcttatcc tgcatctctc 2041 tcagccttga ct // gene della beta-globina umana Il contenuto di informazioni del DNA umano dato dallalternanza di 4 lettere A, G, T, C
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  • Alcuni dati sul genoma umano 3 miliardi di paia di basi 2% codificanti Circa 20.000 geni diversi Pi di 10 milioni di variazioni
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  • Non siamo tutti uguali
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  • Non esiste ununica sequenza del genoma umano, ma circa il 10% dei 3 miliardi di paia di basi che compongono il genoma umano variano da individuo a individuo e costituiscono dei polimorfismi genetici.
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  • I. Single Nucleotide--SNPs G A II. indel (inserzioni/delezioni) TGACG TG Variable Number of Tandem Repeats Polimorfismi genetici Forme alleliche diverse di una stessa sequenza presenti in pi dell1% degli individui di una popolazione
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  • SNPs Variazioni di sequenza comuni Possono essere silenti Possono avere un significato funzionale diretto (es. Cambio aminoacidico) Possono essere semplicemente associati ad altre variazioni di sequenza con significato funzionale
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  • I polimorfismi possono essere responsabili di una diversa suscettibilit alle malattie
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  • In questo caso le alterazioni geniche rappresentano fattori di suscettibilit, ciascuno dei quali contribuisce in una certa misura alla malattia, che si manifester soltanto quando i fattori di rischio nel loro insieme (geni e ambiente) superano una data soglia
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  • come pure della variabilit individuale nella risposta alla terapia farmacologica
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  • paziente giusto Farmaco giusto dose giusta Esamina le varianti genetiche che determinano la risposta ad un farmaco e studia il modo in cui queste varianti possono essere usate per prevedere il tipo di risposta Farmacogenetica
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  • Selezione sulla base di fattori predisponenti alle malattie diagnosi precoce Selezione sulla base di fattori responsabili di una diversa risposta al trattamento Terapia personalizzata
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  • Next generation sequencing
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  • Confronto di efficienza tra diverse piattaforme per il sequenziamento
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  • 1000 genomes project (iniziato nel 2008 mira a sequenziare il genoma di 2500 individui in 27 popolazioni )
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  • La necessit di un approccio informatico alla ricerca nel settore biomedico deriva da questa recente esplosione di informazioni biologiche generate dalla comunit scientifica
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  • BIOINFORMATICA Disciplina situata allinterfaccia tra informatica e scienze biologiche (quali la biologia molecolare e la genetica) che applica algoritmi informatici per la risoluzione di problemi biologici
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  • In ogni istante della propria vita ogni cellula umana contiene: 46 cromosomi (20.000 geni) 10-15.000 mRNA diversi DNA RNA Proteine Flusso delle informazioni genetiche
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  • Fegato Corteccia cerebrale Muscolo liscio Hanno tutte lo stesso genoma, perch queste cellule sono cos diverse in morfologia e funzione? Perch esprimono geni diversi
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  • ESPRESSIONE GENICA E un processo molto complesso e finemente regolato che permette ad una cellula di rispondere dinamicamente sia agli stimoli ambientali che alle sue stesse necessit di cambiamento
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  • Misurare lespressione di un gene significa.... Dare una valutazione quantitativa della presenza dei trascritti (molecole di mRNA) o delle proteine codificate da quel gene nelle cellule in esame
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  • I microarray possono misurare lespressione di tutti i geni noti in poche ore Misurare il trascrittoma Rapidi miglioramenti nella misurazione dellespressione dei geni
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  • Trascrittoma L'insieme di RNA messaggeri espressi da ogni cellula Proteoma L'insieme di proteine espresse da ogni cellula
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  • Tecnologia dei microarray Sfrutta la capacit di una data molecola di mRNA di ibridizzare con il DNA stampo da cui stata generata
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  • Espressione genica differenziale: valuta le differenze nellespressione genica tra due trascrittomi cellule trattate con un composto esogeno a confronto con cellule non trattate un tessuto tumorale a confronto con uno sano Composto esogeno
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  • Campione 1 Campione 2 cDNA Cy3 Cy5 RNA +
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  • Acquisizione dellimmagine mediante scanner Cy5Cy3
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  • Lintensit della fluorescenza proporzionale alla quantit di molecola target nella soluzione e, quindi, costituisce una stima della quantit di RNA per ciascun gene espresso dalla cellula.
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  • Fonti di confondimento in un esperimento microarray Qualit dellRNA estratto Retrotrascrizione Marcatura Deposizione delle sequenze sul vetrino Disomogeneit della superficie del vetrino Ibridazione Lavaggi Acquisizione dellimmagine
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  • REPLICHE SPERIMENTALI REPLICHE BIOLOGICHE Stesso RNA testato su due vetrini distinti RNA proveniente da campioni simili ma distinti
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  • Tipico esperimento Microarray
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  • Analisi computazionale dei dati

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