Die epidermale DNS-Synthese während des Aufbaus einer experimentellen Akanthose beim Meerschweinchen

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    10-Jul-2016

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  • Arch. klin. exp. Derm. 236, 53--60 (1969)

    Die epidermale DNS-Synthese wtihrend des Aufbaus einer experimentellen Akanthose

    beim Meerschweinchen*

    W. Bo~

    Universiti~ts-Hautklinik Freiburg i. Br. (Direktor: Prof. Dr. K. W. Kalkoff)

    Eingeg~ngen am 2. Janu~r 1969

    Epidermal DNA Synthesis in Early Experimental Acanthosi8 o/the Guinea-Pig

    Summary. After daily treatment of 8 guinea pig flanks with yellow petrolatum for one week the number of cells in DNA synthesis labelled by Tritium Thymidine was increased, and more silver grains per labelled cell were counted. The correla- tion of these findings indicates a shortened intermitotic life span and a more rapid and concentrated duplication of the cellular genetic substance during the S phase of generation cycle. The statement "more cells prepare faster for their mitosis" summa- rizes the proliferative background of this epidermal reaction.

    Zusammen/assung. Nach t~glieher Behandlung yon 8 Meerschweinehenflanken mit gelber Vaseline fiir die Dauer einer Woche warden vermehrt in DNS-Synthese befindliehe, Tritium-Thymidin-markierte Zellen nachgewiesen und mehr Silber- kSrner pro markierte Zelle gez~hlt. Das Zusammentreffen beider Befunde zeigt eine verkfirzte intermitotische Lebensdauer der ZeUen und eine beschteunigte Verdoppe- lung des genetischen Materials der einzelnen Zelle in ihrer DNS-Synthesephase an. Die Feststellung ,,mehr Zellen bereiten sehneller ihre Mitose vor" kennzeichnet die proliferative Genese der untersuchten Epidermisreaktion. -- Die vergleichende Be- stimmung der mittleren Silberkornmenge l~l~t erkennen, ob erhShte Markierungs- indices auf einer verktirzten Zellruhephase odor einer verl~ngertcn DNS-Synthese- phase, desgleichen ob erniedrigte Markierungsindiees auf einer verl~ngerten Zell- ruhephase oder einer verkiirzten DNS-Synthesephase beruhen. Das Produkt aus Markierungshldex und Silberkornindex zeig~ die aktuelle DNS-Syntheseleisttmg des Gewebeverbandes an.

    ~nderungen der Breite des Bandes, als welches die Epidermis histo- logiseh zu sehen ist, k6nnen in vergleichbaren orthograden Sehnitten auf Gr61~en/~nderungen der einzelnen Zellen sowie der intereelluls Rs beruhen oder Folge einer St6rung im sog. s teady state dieses Zel lverban- des sein. Bewegen sich Epidermisbrei te und Zellzahl parallel, beruht also eine etwa gefundene Epidermisverbrei terung auf einer Vermehrung der

    * Die Untersuchungen wurden durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefSrdert.

  • 54 W. Bo~N:

    Epidermiszellen, dann fragt sich, ob die Ursache hierffir in einem gestei- gerten Zellnachschub oder in verminderter peripherer AbstoSung bzw. verz6gerter Verhornung zu sehen ist. Umgekehrt stellt sich bei einem sehmalen Epidermisband die Frage naeh einer m6gliehen Entstehung dureh verminderten Zellnaehsehub oder durch vermehrten postmito- tisehen Substanzverlust.

    Da autoradiographische Untersuchungen der DNS-Synthese bei sol- chen Ver/~nderungen zur Aufkl/irung ihrer Genese beitragen k6nnen, an mensehlichen Geweben in vivo jedoch nur ausnahmsweise in Betraeht kommen, besehr/~nken sieh die Experimentierm6glichkeiten weitgehend auf Tierversuehe and auf Gewebeinkubationen in vitro. Untersuehungen der DNS-Synthese in der Epidermis yon Laboratoriumstieren k6nnen so als methodisehe Erg/~nzung und zur siehereren Interpretation der an fiber- lebendem Biopsiematerial erh/~l~lichen autoradiographisehen Befunde dienen.

    Eine Hyperplasie des Deekepithels der Haut yon Versuchstieren 1/~I~ sieh auf einfaehe Weise dureh troekenes l~eiben erzeugen. Die Wirkung wird wesentlieh verst/~rkt unter Zusatz yon Vaseline, wie sie als Salben- grundlage gebr/tuchlieh ist (Gaudin, 1948), obwohl der Gebraueh eines solehen Gleitmittels den ursprfingliehen Reibeffekt sicher verringert (z. B. Naylor).

    Aus dem Verhalten der DNS-Synthese unter Vaselineeinflu2 kann auf die Entstehungsweise der resultierenden Zellvermehrung gesehlossen werden.

    Ffir diesen Versueh schien ein kleines Tierkollektiv ausreichend, da mi~ Vaseline ohne Schwierigkeiten eine typische Hyperplasie der Meer- sehweinehenepidermis herbeizufOhren ist; insbesondere mi~ Rficksieht auf die vorgesehene GanzkSrpermarkierung mR radioaktivem Thymidin wurde eine bestm6gliehe VersuehsSkonomie ohne Beeintr~chtigung des statistisehen Sieherungsbedfirfnisses ffir anfaliende Versuehsergebnisse angestrebt.

    Material und Methodik

    8 weft]e, m~nnliche, 360--480 g schwere Meerschweinchen wurden in Einzel- k/s und auf Wiesenheuunterlage bei Altromin-Standarddi~t und Leitungswasser (Mengen naeh Bedarf) gehalten und zu Beginn des Versuchs beidseitig an der Flan- kenhaut auf etwa 25 cm 2 groBen Arealen mit einer elektrischen I-Iaarschneide- maschine geschoren. Danach wurden zwei in ihrer Gewichtsverteilung einander m6glichst ~hnliche Gruppen gebfldet, deren eine durch Zufallsentscheid (Miinzen- wurf) fortan Versuchsgruppe (V) im engeren Sinne und deren andere Kontrollgruppe (K) war. Die Flanken der V-Tiere wurden t~glich einmal am Nachmittag (pro Feld 1 rain lang nach der Uhr) mit dem Zeigefinger (Gummifinger]ing) ohne besonderen Druck reichlich mit gelber Salbenvaseline bestrichen, die Flanken der K-Tiere erhiel- ten die gleiche Behandlung ohne Vaseline. Am 8. Tag wurde zwischen 10 und 11 Uhr vormittags Tritium-Thymidin (1 [xCi/g Tiergewicht) intraperitoneal injiziert. Je-

  • Epidermale DNS-Synthese beim Meersehweinchen 55

    wefts 60 rain spiter erfolgte durch Scherenschlag in Xtherkurznarkose die Probe- entnahme eines zentral gelegenen Hautstfickchens aus jedem Testfeld. Die l:faut- stfieke wurden ohne Sp~nnung mit der AuBenseite auf Korkplittehen geheftet und in 4~ neutraler gepufferter FormollSsung 24 Std fixiert.

    Das zur Injektion verwendete Pyrimidinnucleosid Thymidin, ein spezifischer DNS-Vorlgufer, war mit dem Wasserstoffisotop Tritium (physikalische Halbwerb zeit 12,26 Jahre) an seiner ~ethylgruppe substitutiert. Die spezifische Aktiviti~t betrug 1,9 Ci/mMol bei ei~lem Molekulargewieht yon 242 und einem radiochemi- schen l~einheitsgrad yon > 99o/o .

    Die sterile w~ib'ige LSsung (Konzentration 1 mCi/ml) wurde in der pro Tier ben5tigten Menge (1 tzCi/g) auf jeweils 2 ml mit physiologischer NaC1-LSsung auf- gefiillt.

    Zur Autoradiographie wurden die Emulsionen G 5 (mittlere KorngrSl~e 0,27 g) und K 2 (m.K. 0,2 ~) der Fa. Ilford, Essex in Gel-Form benutzt. Expositionsdauer 1 Woehe bei 4~ im liehtdieht gemachten Kiihlschrank unter reichlicher Zugabe yon Silieagel als Trockenmittel.

    F~rbung der entwiekelten Autoradiograrnme durch die sich wenig miff~rbende Filmschieht hindurch mit tti~matoxylin und Eosin in geringen Konzentrationen so, daI~ in farblich blal~ getSnten Pr~paraten die als kleine schwarze Punkte sich~baren Gruppen yon SilberkSrnerll gut erkennbar blieben.

    Sowei~ die mikroskopische Auswertung der histologisehen Sehnitte das Z~blen yon autoradiographischen Markierungen dureh 3H-Thymidin betraf, galten unter der Voraussetzung eines geringen v_nsl~ezifisehen Untergrundes alle Zellen mit mindestens drei SilberkSrnern fiber dem Kern als markiert. In Gesichtsfeldern olme jeden er- kem~baren unspezifischen Untergrund wurden auch Kerne mit nur ein bis zwei Silberk6rnern gewertet.

    Lingenmessungen in willkiirlichen Einheiten zum Vergleich verschiedener Epi- dermisdieken erfolgten mit einem Ocular-Schraubenmikrometer, ]~bertragungen in metrische Einheiten mit einem Objektmikrometer (Teilung i/i00 ram).

    Zur Z~hlung yon Epidermiszellen wurde eine das runde mikroskopisehe Gesichts- feld yon zwei Seitenparallel einengende Sehli~zblendeim Ocular (drehbar) angebraeht, so dab die Zel]z~hl des Eloidermisbandes in der gew~.hlten einheitliehen Gesichtsfeld- breite vergleiehend bestimmt werden konnte. Dabei wurden, ghulich dem gewohnten Verfahren bei der BlutzellenzEhlung, auf der einen (linken) Seite die nut teilweise sichtbaren ZeUen mitgezihlt, nieht aber auf der anderen (rechten) Seite.

    Bei dem Versach wurden nur Deckepithelstreeken ausgewertet, welche je etwa eine Follikelbreite yon benaehbarten Follikeln entfernt begannen bzw. endeten. Im einzelnen wurden aus 16 Tierflanken je etwa 10--20 histologisehe Schnitte fiir die Durchmusterung vorbereite~ und dienten soweit erforderlieh zur Gewinnung folgender 1VIeB- und Zi~hlwerte:

    Je Probe 10 1Vfikrometer-~essungen der Epidermisdicke. Ermittlung der Zellzahlen pro L~ngeneinheit Epidermisband fiber mindestens

    9 ram, aufgeteilt in interfollikulEre Teftstreeken. Auszghlung des Markierungindex ffir jewefts mehr als 1000 Basalzellen. $'eststellung der mittleren Silberkornzahl pro markierte Basalze]le.

    Ergebnisse ErwartungsgemaB wurde die Epidermis der vasel inebehandelten Tiere

    gegen/iber derjenigen der koa~rollbeh~ndel~en Tiere verdickt gefunden (Tab. 1). Die Verdickung entsprach in ihrem AusmaB der registr ierten Zel lvermehrung (Abb. 1) und is~ dami~ ausreichend erkli~rt. Gleiehzeitig

  • 56 W. BOnN:

    Tabelle 1. Morphologischer Vergteich der Flankenepidermis yon 4 mit gelber Salben- vaseline vorbehandelten Meerschweinehen gegeni~ber 4 Kontrolltleren. Angabe der

    Vertrauensgrenzen ]iir 950/0 ige Riicksehluflwahrscheinlichkeit

    Epidermisdieke in willkiirlichen Mikro- mer

    Zellzahl pro Standardstrecke Epidermis

    Kontrollserie Versuehsserie Kontrollserie Versuchsserie

    147 333 759 1679 136 374 627 1509 167 383 653 1588 160 395 699 1567

    Durchsehnitt Durchschnitt Durchschnitt Durchschnitt 1534-22 371 685 1636

    Tabelle 2. Autoradiographiseher Vergleich der Flankenepidermis yon 4 mit gelber Salbenvasetine vorbehandelten Meersehweinehen gegeniiber 4 Kontrolltieren. Angabe der

    Vertrauensgrenzen [iir 95 ~ ige Ri~ekschluflwahrscheinlichkeit

    DNS-Markierungen pro Standardstrecke Epidermis

    SilberkSmer pro 100 m~rkierte BasMzellen

    Kontrollserie Versuchsserie Kontrollserie Versuchsserie

    221 533 457 666 168 651 486 810 91 633 361 605 98 484 556 990

    Durchschnitt Durchschnitt Durchschnit~ Durchschnitt 1454-98 575J=127 465~=131 768

    wurden bei den Vaselinetieren etw~ 4mal mehr Zellen in DNS-Synthese befindlieh angetroffen als bei den Kontroll~ieren (Tab. 2 und Abb. 1). Die Zahl der SilberkSrner fiber den Basalzellen der Vaselinetiere betrug dabei im Mittel das 1,65 faehe des mittleren Kontrollwertes (Tab. 2 und Abb. 1).

    Die s~atistisehe Sicherung der Unterschiede (Verwerfung der Null- ttypothese) mit Hilfe des t-Tests ergab jeweils eine Irrtumswahrschein- liehkeit yon weniger als 0,1~ (2 p ~ 0,001).

    Besprechung der Befunde

    Der vergleichsweise hohe Prozentsatz gerade DNS synthetisierend angetroffener intermitotiseher ]3asalzellen wird Ms Ausdruck einer relati- yen Verliingerung der DNS-Synthesezeit der Einzelzellen innerhalb ihrer wiihrend der Stichprobenentnahme ~blaufenden Generationseyelen gesehen, wobei die absolute Dauer der DNS-Synthesephase ebenfalls verl~ngert oder aber verktirzt bzw. unver~ndert sein kann.

  • Ep]derma|e DNS-Synthese beim Meerschweinchen

    71- 6,5

    57

    Ver b

    Abb.1. Ver~nderungen in der Meersehweinehenepidermis (~'lankenhaut) infolge einwSehiger Lokalbehandlung mit~ gelber Salbenvaseline. Darstellung der morpho- logisehen und eul~oradiogr~phisehen Befunde Ms Mittelwerffakl)oren des jeweils

    g~.eieh 1 geset~zgen l~Iitt~elwer~es der Kontrollen

    Die mSglichen Beziehungen zwischen der Dauer der Generationszeit und der Dauer der DhTS-Synthesezeit in ihren Auswirkungen auf den feststellbaren Markierungsindex sind in Tab. 3 veranschaulicht. Danach ist jeder isoliert betraehtete Markierungindex zun/~chst vieldeutig und kana ohne Zusatzkriterien nicht schlfissig interpretiert werden. Auf analoge grunds/~tzliehe Irrtumsm6glichkeiten bei der ]~eurteilung ver- /~nderter Spontanmitose-Indices haben schon 1952 Trincao, Parreira, Franco u. Gouveia anhand paradox erscheinender Befunde an Knochen- markkulturen yon Schlafkranken hingewiesen.

    Die Feststellung, da$ ein erhShter Markierungsindex angesichts der Ausbildung einer auf Zellvermehrung beruhenden Epidermisverdickung angetroffen wurde, f~ihrt alleln nicht weiter. Als Entstehungsmechanis- mus k/~me eine gest6rte, verlangsamte DNS-Synthese, verbunden mit verzSgerter peripherer Zeltdifferenzierung (Verhornung) naheliegend in Betracht. Tatsachlich ~st im Schrifttum der Versuch zu finden, die Vase- linewirkung als Abdeckeffekt zu erklaren (Berres).

    Bei geeigneter Versuchsanordnung last sich anhand der Silberkorn- zahlen als Ausdrnck der Markierungsintensit/~t der Einzelzelle jedoch

  • 58 W. Bo~:

    T~belle 3. ~bersivht zur Wahrschelnlivh~eit, alsbald nach einmaliyem Tritium- Thymidinangebot mehr oder weniger h~iu/ig eine DNS synthetisierende (Tritium- Thymidin-markierte) Zelle in einer Stichprobe anzutre//en in AbMinglgkeit yon der mittleren Dauer der Generationszeiten und der darin enthaltenen DNS-Synthesephasen. Die Stichproben seien in beliebiger Zahl gleichmgflig au] die Generationszeitraum-

    Strecken verteilt

    Generofionszeilroum

    I i l ! i i i I I I i i i I i ver[~Jngert

    t ~ unver~ndert

    I ; verkOrzt

    dGdn BNS-Synthesezeiten

    I~ veri6ngert

    1~ unvedJndert [ ] verki~rzt I= Siichproben

    wiIikOfliche Zeileinhei~en

    Es ergeben sich folgende Beziehungen: Bei einer verldngert ungenommenen Generationszeit der ZeHe verursachen

    unver~ndert bleibende DNS-Synthesezeiten, dab in der Stichprobe jeweils weniger D/qS synthetisierende Zcllen gefunden werden; noch weniger werden es, wenn die DNS-Synthesezeit gleichzeitig verkfirzt ist. Eine Verl~ngerung der DNS-Synthese- zeit um den gleichen F~ktor wie bei der Generationszeit l~Bt den Markierungsindex unver~ndert erscheinen. Erst eine noch st~rkere Verl~ngerung der DNS-Synthese- zeit kann zu erh6hten Indexwerten ffihren.

    Bei einer unver~indert angenommenen Generationszeit der Zelle verursachen verl~ngerte DNS-Synthesezeiten, dab in Stichproben jeweils mehr I)~qS syntheti- sierende Zellen gefunden werden, verkiirzte DNS-Synthesezeiten hingegen, dab ]eweils weniger davon zu finden sind.

    Bei einer verM~rzt angenommenen Generationszeit der Zelle verursachen unver- ~ndert bleibende DNS-Synthesezeiten, dab in der Stichprobe jeweils mehr DNS synthetisierende Zellen gefunden werden, verl~ngerte DNS-Synthesezeiten einen noch sti~rkeren Anstieg dieser Zellzah]en. Eine Verkfirzung der DS~S-Synthesezeit um den gleichen Faktor wie bei der Generationszeit l~Bt den Markierungsindex unver~ndert erscheinen. Erst eine noch st~rkere VerkSrzung der DNS-Synthesezeit kann zu er- niedrigten Indexwerten f/ihren.

    fesgstellen, ob das befristeg angebotene Trit ium-Thymidin begierig im Rahmen einer konzentriert ablaufenden DNS-Synthese oder relativ z6gernd in einer eher schleppend vor sich gehenden Synthesephase auf- genommen wurde. W&hrend des Aufbaus einer Vaselineakanthose der Flankenepidermis des Meerschweinchens erscheint der Sflberkornindex fiber die Norm gesteigert (Abb. 1). Das l&B~ auf eine DNS-Synthesezeit yon h6chstens normaler, wahrscheinlich verkfirzter Dauer schlieBen,

  • Ei0idermale DNS-Synthese beim Meerschweinchen 59

    woraus sieh bei dennoch erh6htem Markierungsindex zwingend eine um so mehr verkiirzte Generafionszeit ergibt.

    Der Charak...

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