Curs 14_Diagnostic de Laborator in Afectiunile Mediate Imun_2013

  • Published on
    09-Dec-2015

  • View
    18

  • Download
    9

Transcript

Immunology 2013. Science can solve problemsDiagnostic de laborator n afeciunile mediate imunCurs 14Immunology 2013. Science can solve problemsImmunology 2013. Science can solve problemsObiective nelegerea diferenelor dintre tehnicile imunologice utilizatepentru diagnosticul afeciunilor imune i cele folosite pentruevaluarea afeciunilor fr implicare imun nelegerea principiilor care stau la baza procedurilor imunologicefolosite n diagnosticul imunologic de laborator Descrierea tehnicilor imunologice relevante care evalueaz diveriparametri ai sistemului imun nnscut i dobndit, organizate nteste de screening, teste funcionale i teste specializate Identificarea utilitii diagnostice a procedurilor imunologice ncondiii clinice specifice, care includ imunodeficienele, bolilealergice i bolile autoimune Dobndirea unei estimri a viitoarelor testri diagnostice imune ia importanei acestora n diagnosticul precoce i terapia adecvatImmunology 2013. Science can solve problemsCuprins1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afeciunilor cu funcie imun modificat2. Evaluarea imunitii nnscute3. Evaluarea imunitii dobndite4. Diagnosticul de laborator al afecinilor alergice5. Diagnosticul de laborator al bolilor autoimuneImmunology 2013. Science can solve problems- Teste ale funciei sistemului imun nnscut (evaluareafagocitelor, celulelor cu rol mediator, NK i complementul)- Teste ale funciei sistemului imun dobndit (activitatealimfocitelor T i B)Clasificarea testelor imunologice ncearc s ofere un algoritmpractic pentru diagnostic n funcie de complexitatea acestora:1. Teste primare (screening)2. Teste secundare (funcionale)3. Teste teriare (specializate) Sunt folosite mpreun cu alte proceduri clinice sau de laboratorpentru testarea funciei imune n diferite stadii diagnostice deboal Bolile autoimune, alergiile, astmul, transplantul de organe i demduv osoas hematogen, procesele maligne limfoide, cuplasmocite sau tumorile solide, imunodeficienele primare isecundare1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afeciunilor cu funcie imun modificatImmunology 2013. Science can solve problemsCategorie Component Primar (screening)Secundar (funcional)Teriar (specializat)Sistem imun nnscutFagocite Mo/MacrofageNeutrofileEozinofileCelule dendriticeHemoleucograma AderenChemotaxieFagocitozActivitatebactericidMolecule de adeziuneChemokinePreluarea particulelorOxidaza NADPHSpecii reactive ale oxigenului(ROS)Celule cu rol mediatorMastociteBazofileHemoleucogram tisularTriptaza Histamina, prostaglandine, leukotrieneCelule NK Perforine / granzimeADCCCD3- / CD16+CD56+Activitate citolitic Perforine Funcia complementuluiC1-C9 CH50, C3, C4 Opsonic (C3b)Anafilatoxina (C3a, C5a)Chemotactic (C5a)Citolitic (C5-9)1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afeciunilor cu funcie imun modificatImmunology 2013. Science can solve problemsCategorie Component Primar (screening)Secundar (funcional)Teriar (specializat)Sistem imun dobnditFuncia limfocitelor BLimfocite HemoleucogramaIgM, IgG, IgA, IgEIgG1, IgG2, IgG3, IgG4ImunofenotipareCD19, CD20Rspuns specific la anticorpi pre-/postFuncia limfocitelor TLimfocite HemoleucogramImunofenotipare diferenialCD3+/CD4+CD3+/CD8+Testarea hipersensibilitii de tip ntrziat in vitroTeste de limfoproliferare in vivo la antigen i mitogen AnalizacitokinicActivitatea citolitic1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afeciunilor cu funcie imun modificatImmunology 2013. Science can solve problems1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afeciunilor cu funcie imun modificatDescoperirile majore ale secolului XX cu cel mai mare impact asupradiagnosticului imunologic:- Tehnologia hibridoamelor Kohler i Milstein (1975) producerea in vitro a unor cantiti crescute de anticorpiomogeni cu o singur specificitate antigenic anticorpimonoclonali-Flowcitometria (FCM) fluorescent activated cell sorting (FACS) tehnologie pentru identificarea molecular utilizarea anticorpilor monoclonali detectarea i caracterizarea diferitelor celule i molecule alesistemului imun epidemia SIDA n 1981 recunoaterea i msurarealimfocitelor T CD4+ (diagnostic, tratament, follow-up alpacienilor infectai cu HIV) evaluarea afeciunilor limfoproliferative, imunodeficienelori alte boli mediate imunImmunology 2013. Science can solve problemsConsideraii generale asupra pacienilor suspectai cuimunodeficiene primare sau secundareSuspiciune de imunodeficien primar (PID)Antecedente heredocolateraleInfeciiTipul agentului infeciosLocalizarea i frecvena infeciilorEecul antibioterapiei n eradicarea infecieiSeveritatea infecieiAnomalii congenitaleValori ale parametrilor de laboratorAutoimunitateIncidena crescut a proceselor maligneCondiii clinice asociate imunodeficienelor primare (PID)InfeciiNeobinuit de severeRecurenteAgeni patogeni neobinuiiInfecii ale sinusurilorMalabsorpieAutoimunitateBoal reumatoidSindroame lupus-likeAbcese, leziuni tegumentareDiaree cronicVindecare incomplet a rnilorReacii adverse la vaccinurile viiAbsena ganglionilor limfatici/amigdaleAbsena timusului pe RxImmunology 2013. Science can solve problemsConsideraii generale asupra pacienilor suspectai cuimunodeficiene primare sau secundareAgeni infecioi asociai PIDDeficitul de anticorpiHemophilus influenzaeStreptococcus pneumonieGiardia lambliaSpecii de CryptosporidiumEnterovirusuri Deficit al imunitii celulare sau combinatCandida albicansPneumocystis carinii (jiroveci)Specii de MycobacteriumCytomegalovirusVirus Epstein-BarrVirus VaricellaEnterovirusuriAgeni infecioi asociai PIDDeficit al fagocitelor/fagocitozeiSpecii PseudomonasSpecii KlebsiellaStaphylococcus aureusSerratia marcescensSpecii NocardiaSpecii Aspergillus Deficit complement sau ale componentelor complementuluiNeisseria meningitidesNeisseria gonorrhoeaeImmunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscuteIstoric medicalTipuri de ageni patogeniRecurena infeciilorRezultate hemoleucogram i diagnostic diferenialEvaluarea flowcitometric a subpopulaiilor limfocitareLimfocite B Limfocite TCantitaie imunoglobulineIzohemaglutinine (anti-A, anti-B)Electroforeza proteinelor sericeRspuns la imunizare specificRspuns la anticorpiExaminare esut limfoidTest limfoproliferare in vitroRspuns DHT la antigeneProducerea de citokine specific-antigenice (FCM, ELISA)Examinare esut limfoidPMNTestarea fenotipic (FCM) CD18/CD11Teste funcionaleFagocitoz, chemotaxie, bactericidieEfecte respiratorii NBT, DHRComplementCH50C3, C4AH50Cantitaie componente CNefelometrieTestarea funcional componente CImmunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscute2.1. Evaluarea funciei fagocitelor- Ce? Monocite circulante, macrofage tisulare, celule mieloide circulante(neutrofile) fagocitoz, activitate intracelular bactericid, inflamaie;celule prezentatoare de antigen (APC)- Cnd? Infecii bacteriene recurente- Cum? Cantitativ i calitativCnd suspectm o disfuncie fagocitar?- Infecii cutanate S. aureus- Gingivit- Afeciuni periodontale- Ulceraii oraleAnomalii neutrofilice relevante din punct de vedere clinic:- Neutropenie- Anomalii de aderen i locomoie neutrofilic- Anomalii ale formrii granulelor intracitoplasmatice- Anomalii ale funciei fagocitareImmunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscuteDefecte cantitative ale fagocitelorTipul de celul Defect alsistemului imun nnscutExemple ManifestricliniceDefect alnumrului de neutrofileNeutropenie Congenital, infecios, malign, boli autoimuneCretereasusceptibilitii la infecii bacterieneDefect al numrului de macrofageSplenectomieSplenectomiefuncionalndeprtareachirurgical a splinei ca urmare a unui traumatismAnemia sickle-cell (siclemia)Creterea susceptibilitii la infecii bacterieneImmunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscuteDefecte calitative ale fagocitelorComponent Defect al sistemului imun nnscutExemple Manifestri cliniceGranule primare i secundareDefecte de formare i de coninut ale granulelorSindrom Chediak-HigashiAlbinism parial, lizozomi uriai, NK i CTL, scderea traficului lizozomal, infecii bacteriene recurenteOxidaza NADPH Defecte ale metabolismului oxidativBoal granulomatoas cronicFormarea granuloamelor, creterea susceptibilitii la infecii bacteriene i fungiceDefecte de adeziune leucocitar (LAD)Defecte ale aderenei ichemotaxiei datorate mutaiilor integrinei, care duc la defecte ale CD18 i CD15, absena/scderea adeziunii leucocitare i migrarea celular Deficit de adeziune leucocitar tip 1 (LAD1)ntrzierea separrii cordonului ombilica, ulceraii tegumentare, periodontit, leucocitozInterferon / IL-12 Defecte ale cii interferon / IL-12BCG Susceptibilitate la infecii cu Salmonella i mycobacteriumImmunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscuteDefectul fagocitar Exemple Analize de laboratorAfeciuni ale celulelor mieloideNeutropenie congenital severNeutropenia ciclicNeutropenia X-lincatNeutropenie persistent i blocareamaturrii detectate prin studii la nivelul BMNeutropenie intermitent care necesit determinri seriate (la intervale de 2-3 sptmni)Expresie WASP alterat (FCM) sau studiide mutagenezDefecte ale formrii granulelor i coninutuluiSindrom Chediak-HigashiSindrom Griscelli tip 2Incluziuni lizozomale gigantice la nivelul granulocitelor (albinism parial)Neutropenie fr incluziuni citoplasmatice (albinism parial)Defecte ale adeziunii leucocitareLAD1LAD2LAD3/- CD18 i CD11 (FCM); leucocitoz persistentFenotip Bombay, absena expresiei CD15Analize mutaionaleDefecte ale cilor de semnalizare citokiniceSindromul hiper-IgEInterferon -/IL-12IgE > 2000 IU/ml, Th17, deficit de STATDefecte moleculare ale cii Interferon -/IL-12, detectate prin FCMDefecte ale metabolismului oxidativGranulomatoz cronic Defecte evideniate prin DHR sau NBTImmunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscute2.2. Evaluarea funciei celulelor cu rol mediator- celulele cu rol mediator sunt: bazofile, mastocite i eozinofile (au iactivitate fagocitar)- au fost identificate 2 tipuri de mastocite:mucoasa intestinal i esutul peretelui alveolar conin doar triptaz[MC(T)] tegumentul normal i submucoasa intestinal conin triptaz ichimaz [MC(TC)] triptaza este crescut n reaciile anafilactice i mastocitoz (valoarediagnostic ca marker al acestor afeciuni)- Histamina mediator vasoactiv potent stocat ca molecul pre-format n granulelecitoplasmatice ale bazofilelor i mastocitelor eliberat mpreun cu ali mediatori ai inflamaiei (leukotriene) nreacii de hipersensibilitate tip I (imediat) eliberarea bazofilic de histamin (BHR) - test cantitativ de potenalergenic (ingestia unui alergen alimentar) i model in vitro de studiual factorilor declanatori ai eliberrii mediatorului din bazofile- Peptidul cationic eozinofilic (ECP) nivel crescut n sput, ser i secreiinazale ale pacienilor cu infecii parazitare, rinit alergic, astmImmunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscute2.3. Evaluarea funciei celulelor NK - Rol important n aprarea anti-tumoral i anti-viral apoptoz (direct- perforine i granzime; indirect - precipitarea IgG i inducerea ADCC =antigen-dependent cellular cytoxicity)- Cnd suspectm o disfuncie a NK? NK n sngele periferic la pacienii cu AIDS, infecii recurente cuvirusul herpetic NK + CTL sunt asociate cu un rspuns inflamator incontrolabilindus de infecie injurie multipl de organe = limfohistiocitozhemofagocitic (HLH); un tip de HLH este sindromul limfoproliferativX-lincat (XLP) = rspuns imun anormal la infecia cu EBV deces ncazul n care nu se efectueaz transplant de mduv osoas- Investigaii de laborator? imunofenotipare (FCM) teste de citotoxicitate eliberarea de 51Cr la 4 ore evaluarea flowcitometric intracelular pentru molecule defective nXPL1 i XPL2: SLAM-associated protein (SAP), X-linked inhibitor ofapoptosis (XIAP)Immunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscute2.4. Evaluarea funciei complementului Immunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscute2.4. Evaluarea funciei complementului Immunology 2013. Science can solve problems2. Evaluarea imunitii nnscute2.4. Evaluarea funciei complementului Cnd suspecm o disfuncie a complementului?Disfunciile complemetului sunt rare (0,03% din populaie)!!- Pacieni cu afeciuni autoimune- Pacieni cu infecii recurente- Pacieni cu angioedem cronic recurentCalea clasic (C1q, C1r, C4 i C2) simptome lupus eritematos autoimun-like, cu infecii recurente sino-pulmonareDefecte ale C3 infecii bacteriene recurente cu Streptococcus penumoniaeDefecte ale cii lectinei infecii acute recurente ale tractului respirator,mai ales la copii (S. Pneumoniae i N. meningitidis), precum i cretereaincidenei bolii reumatismaleDefecte ale cii alternative infecii recurente cu N. MeningitidisCum evalum funcia complementului?-Complementul hemolitic total CH50 (calea clasic)-Funcia cii alternative AH50-Nefelometria prezena i cantitatea componentelor complemetului, dar nudetermin funcia acestoraImmunology 2013. Science can solve problems3. Evaluarea imunitii dobnditeStandard imunofenotipare flowcitometric (FCM)- Limfocite T citotoxice (CD3+CD8+)- Limfocite T helper (CD3+CD4+)- NK (CD16+CD56+)- Limfocite B (CD19+) (4-10% limfocite)3.1. Evaluarea funcie limfocitelor BCnd suspectm o disfuncie a limfocitelor B?- Agamaglobulinemia X-lincat (Bruton, 1952)- Infecii repetate cauzate de microorganisme comune ncapsulate: S.Pneumoniae, S. Aureus, H. Influenzae tip b, N. meningitidis- Diaree (25% din pacienii) asociat cu infecii cu Giardia lamblia- Pacieni care nu rspund la imunizarea specific tetanos/difteria,vaccinul anti-H. Influenza tip b (vaccin cu virus atenuat), vaccinul anti-polio (vaccin cu virus viu administrat oral)Immunology 2013. Science can solve problems3. Evaluarea imunitii dobndite3.1. Evaluarea funciei limfocitelor BEvaluarea de laborator a funciei limfocitelor BTestarea limfocitelor B se face prin teste in vivo - vaccinareVaccinurile proteice (tetanos) evalueaz rspunsul imun dependent de limfocitele TVaccinurile polizaharidice (Pneumovax) evalueaz rspunsul imun independent de limfocitele TAntigenele recall anticorpii produi au fcut switching-ul de clas (IgG)Neoantigene antigenul este nou pentru sistemul imun; anticorpii produi sunt de tip IgM la prima vaccinare i de tip IgG la a doua vaccinareImmunology 2013. Science can solve problems3. Evaluarea imunitii dobndite3.1. Evaluarea funciei limfocitelor BTeste de screening- CBC (complete blood count = hemoleucograma)- Nivelul de imunoglobuline nefelometrie (IgM, IgG, IgA) i IgE(ELISA); niveluri < 300 mg/dl la adolescen/aduli i < 95%valoare de referin la copii deficit imunoglobulinic- Electroforeza proteinelor serice- Determinarea anticorpilor naturali anti-grup sanguin(izohemaglutinine)- Imunizarea pacientului cu vaccin proteic (tetanos/difteria) ivaccin polizaharidic (vaccinul penumococic) i determinareatitrului anticorpilor nainte i la 3-4 sptmni de la imunizareTeste specifice- Flowcitometrie (CD19+, CD20+)- Teste in vitro de stimulare a proliferrii cu ageni mitogeni (PHA,LPS, Concavalina A)Immunology 2013. Science can solve problems3. Evaluarea imunitii dobndite3.2. Evaluarea funciei limfocitelor TCnd suspectm o disfuncie a limfocitelor T?- diaree, infecii recurente cu ageni patogeni oportuniti (Candida albicans,Pneumocystis jiroveci, CMV), infecii bacteriene cu localizri multiple,infecii persistente, n ciuda tratamentului corespunztor- erupii cutanate- noduli limfatici nepalpabili, absena timusului (atenie! Stressul poateinduce reducerea imaginii Rx a timusului n 50% cazuri)Evaluarea de laborator a funciei limfocitelor T- Teste de screening- Teste specificeImmunology 2013. Science can solve problems3. Evaluarea imunitii dobndite3.2. Evaluarea funciei limfocitelor TNivelul testului diagnosticInvestigaiiTeste de screening CBCTestare HIVImunofenotipare limfocitarTestare cutanat a hipersensibilitii de tip ntrziatTeste specifice Proliferarea limfocitelor T (ageni mitogeni)Producia de citokine limfocitare (ELISA)Evaluare flowcitometric a proteinelor de suprafa sau intracitoplasmatice CD40L (CD154 pe suprafaa limfocitelor T activate), lanul g al IL-2R (CD132), MHC-I, lanul a al IL-7R (CD127), lanurile CD3, WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)Teste enzimatice: adenozin deaminazaFISH pentru deleia 22q11Analiza repertoriului TCRAnalize mutaionale