Bildung von 17α-Hydroxy-Δ5-pregnenolon und 3β-Hydroxy-17-keto-Δ5-androsten (DHA) in Nebennieren- und Testes-Gewebe

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    19-Aug-2016

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15. I. 1961 Brevi eonrnnicazioni - Brief Reports 19 Measurements of the spacings and relat ive intensit ies f rom the electron di f f ract ion pat terns are shown in the Table. In th is Table are also shown the X - ray di f fract ion data of natura l apat i te ~. The compar ison of both data have sat is factor i ly shown agreement in the spacing values and in the re lat ive intensit ies; therefore it follows that the crystal l ine component of the shark enamel has the same s t ructure of the minera l apat i te as is present in human enamel . As occurs in human enamel n, electron di f f ract ion pat terns clearly showing preferent ia l or ienta- t ion of the crystal l ine component were also obta ined (Fi- gure 3). The enamel of the shark Odontaspis, hav ing its u l t ras t ructure very s imi lar to the human's enamel and hav ing been now establ ished the ident i f icat ion of its crys- tal l ine component as natura l apat i te , can be concluded to be a t rue enamel . The ease wi th which the crystal l ine apat i te of the shark Odontaspis is detached f rom the enamel in tooth sections makes it a very conven ient mater ia l for the s tudy of its u l t rast ructure , as well as a sui table source of tooth apat i te for crysta l lographic studies. Studies to establ ish the de- tai led or ientat ion of these rods in the shark tooth enamel is under course and will be publ ished elsewhere. Rdsumd. L 'auteur constate que dans la dent du Requin du genre Odontaspis l ' u l t ras tucture de la substance qui re- couvre la dent ine est morpho log iquement tr&s semblable ~t celle de l 'dmai l de la dent humaine . Par di f f ract ion dlectro- n ique le composant cr istal l in de l 'dmai l du Requin a dt6 ddtermind comme dtant de l 'apat i te. Ces rdsultats mont rent que le rev~tement externe de la dent d'Odontaspis peut ~tre considdr6 comme un vdr i table 6mail. HELENA DE SOUZA SANTOS and W. DA SILVA BASSO Electron Microscopy Section, Polytechnical School, Uni- versity o] STzo Paulo; Department o[ Histology, Faculty o] Farmacy and Odontology, University o] STto Paulo ( Brasil), August 15, 1960. Bildung von 17a-Hydroxy-AS-pregnenolon und 3fl-Hydroxy-17-keto-/tS-androsten (DHA) in Nebennieren- und Testes-Gewebe ~ Kfirzl ich ber ichteten wir fiber daB Vorkommen einer- spits yon 17~-Hydroxy-AS-pregnenolon (3fl, 17a-Dihydro- xy-20-keto-A6-pregnen) in Schweinenebennieren und an- derseits yon DHA (3f l -Hydroxy-17-keto-A*-androsten) in St ierhoden*). Diese Befunde tiessen zum ersten darauf schliessen, dabs der t iber die As-Steroide ft ihrende Bio- syntheseweg der Androgene nicht, wie angenommen s, ausschl iessl ich fiir Nebennieren gilt, sondern auch ffir Hodengewebe; letzterer Schluss ist nur st ichhalt ig unter der Voraussetzung, daBs das aufgefundene DHA n icht bei- gemischtem neoplast ischem Gewebe ents tammte 4. Zum andern war bei der bekannten Paral lel itAt zwischen DHA- Ausscheidung und Nebenn ieren-Funkt ion dab offensicht- l iche Feh len yon DHA in normalem Nebennieren-Gewebe s und Nebenn ieren-Venenb lut s noch kein Beweis daffir, daBs es in der Nebenniere i iberhaupt n icht gebi ldet werden kann nnd ausschliessl ich als per ipheres Abbauprodukt yon adrena lem 17x-Hydroxy-AS-pregnenolon bet rachtet wer- den muss ~. Wi r pr i i f ten deshalb, ob normales Nebennieren- und Hoden-Gewebe des Rindes in vitro fAhig ist, A6-Pregnen- olon in 17~-Hydroxy-An-pregnenolon i iberzuff ihren und letzteres zu DHA abzubauen. Je 100-400 g schlachtfr isches Gewebe wurde, wie frfiher angegeben s, bei pH 7,4 homogenis ier t und gegebenenfal ls in der Kitlte f rakt ion ier t zentr i fugiert (5000 g), so dabs man 2 F rakt ionen erhielt : R dab Zentr i fugat und L die fiber- s tehende LOsung. Sowohl Tota lhomogenat wie F rakt ionen R und L wurden unter Zusatz yon 100 mg ATP, 100 mg DPN, 50 mg DPNH, 25 mg TPN und 5 mg TPNH pro 200 g Gewebe zwischen pH 7 und 8,5 wRhrend 3 h bei 35C unter Durch le i ten yon 1-1,5 1 Sauerstof f /min inku- biert. Die Stero id-Vorstufen wurden in 5-10 ml )kthanol gelOst oder suspendier t zugegeben. Die nach Eingiessen der inkub ier ten Homogenate in insgesamt 16 1 Aceton er- ha l tene Aufsch lgmmung f i l tr ierte man nach 12 h bei 0C, wusch den Rt ickstand mi t Aceton, engte die verein igten F i l t rate auf 1,5 1 Pin und ext rah ier te siP mi t 4 800 ml Chloroform. Die meist 2-5 g wiegenden Chloroform-lRiick- s t~nde wurden an 40-100 g Silicagel Davison adsorb ier t und je nach Ar t des e ingesetzten Subs , rates und des zu best immenden Umsetzungsproduktes mi t 0,8-2 l Benzol- CHCI 3 (1:1) und 0,4-1 1 CHCl3 -Aceton( l : l ) (fiir 17c~-Hy- droxy-AS-pregnenolon) bzw. mi t 2 1 Benzol und 1 1 CHC13- Aceton (1 : 1) (fLir DHA) eluiert. Die CHCls-Aceton(1 : 1)- Eluat-Rfickst~tnde (0,5-2 g) setzte man mi t je 1 g Girard- Reagens T und 2 g Amber l i te IRC 50 (H +) in 100 ml Athano l 20 h bei 20C urn, isolierte auf i ibl iche Weise die bei pH 1 leicht und schwer spa l tbaren keton ischen Antei le und chromatograph ier te siP prAparat iv auf je 2-20 B la t t Pap ier mi t dem System F/Cy-Be(1 : 2) 9. Die den gesuchten As-Steroiden entsprechenden Zonen wurden eluiert und analyt isch im System Bush-B 3, -A und Propylenglyko l / Toluol rechromatograph ier t ; die Auswertung erfolgte ha lbquant i ta t iv durch visuel len Vergleich mit S tandard- substanzen, wobei Farbreakt ionen mi t SbC13 (ftir A 5- Steroide) oder a lkal ischem m-Din i t robenzol (ffir 17-Keto- steroide) benutz t wurden. Bei Verwendung von Tr i t ium-mark ie r ten Verb indungen verz ichteten wir auf die Girardierung, f i ihrten aber die S i l icagelchromatographie di f ferenzierter aus. Ferner wurde ffir die Isol ierung von mark ie r tem t7,t -Hydroxy-A 6- pregnenolon, aus den AnsAtzen mi t AS-Pregnenolon-Ta- SH, nach der ersten pr~.parat iven Chromatograph ie eine zweite mi t Propylenglykol /To luo l eingeschaltet. DaB 1 173. Mitteilung fiber Steroide; 172. Mitteihrng: P. WIELANO, K. HEUSLER und A. V~C'ETTSTEIN, Helv. ehim. Aeta 43, 2066 (1960). z R. NEHER und A. WETTSTEIN, Acta endoerinol. 35, 1 (1960). 3 R.I. DORFMAN, in E. MOSETTIG, Proc. IV. Internat. Congr. Bio- chemistry, Vienna, Vol. 4, London (1959), 175. * Zur in vitro Bildung geringer Mengen yon DHA dureh einen viri- lisierenden Hodentumor vgl. K. SAVARD, R. I. DORFMAN, B. BAG- GETT, L.L. FIELDING, L.L. ENGEL, H.T. McPIIERSON, C.M. LISTER, D. S. JOHNSON, E. C. HAMBLEN und F. L. ENGEL, J. clin. Invest. 39, 534 (1960). s Eine Ausnahme scheint foP,ales rnenschliches Nebenuit r:ngewebe zu bilden, dessen DHA-Gehalt mit zunehrnendem Alter rasch abnimrnt: E. Bt.ocH, K. BENIRSCHKE und E. ROSEMBERG, Endo- crinol. ~8, 626 (1956). s DHA ist bisher in nmnschlichern Nebennierenvenenblut nut ill einem Fall yon Virilismus und Hirsutismus nach ACTH-Stimuliel rung analytisch nachgewiesen worden: I. E. Busll, J. SWALE und J. PATTERSON, Biochem. J. 62, P 16 (1956). - I. E. BUSL und V. B. MAHESIt, J. Endocrinol. 18, 1 (1959). In 4 weitere F~tllen handelt es sieh urn Patienten mit Marnrn-Careim in: R. E LOM- BARDO, C. McMORRIH und P. B. HUDSON, Endocrinol. 65. 426 (1959). - R. V. SHORT, Biochem. Soc. Symposia No. 18, 74 (1960). 7 S. LIEBERMAN und S. TEICH, J. clin. Endocrinol. 13, 1140 (1953). s F.W. KAHNT R. NEHER und A. WETTSTEIN, Helv. chirn. Acta 3s, 1237 (1955). g Irnpr~ignierung yon WHATMAN-Papier No. 1, mit 20% Formarnid in Aeeton; absteigende Chrornatographie; mobile Phase Cyelo- hexan-Benzol (1:2). 20 Br~ves communications - Kurze Mitteilungen EXPERIENTIA XVII/I zweite 17c-Hydroxy-AS-pregnenolon-halt ige E luat wurde nun nach Zugabe yon 10-11 mg inakt ivem 17~-Hydroxy- AS-pregnenolon mi t Acetanhydr id in Pyr id in acety l iert und bis zur Konstanz der spezif ischen Radioakt iv i tS.t um- kristal l is iert, Gem~tss Schmelzpunkt und pap ierchromato- graph ischem Verha l ten erwies sich das P rodukt als reines 17e-Hydroxy-A S-pregnenolon-acetat. F i i r die Isol ierung yon mark ie r tem DHA, aus den An- s/ itzen mi t 17c~-Hydroxy-AS-pregnenolon-~H, wurde das entsprechende E luat des ersten pr / tparat iven Papier- chromatogrammes nach Zugabe yon 1 mg inakt ivem DHA im Bush-B3-System rechromatograph ier t und nach Ab- t rennung und E lu t ion nochmats mi t 2,5 mg inakt ivem DHA vermischt . Die folgenden Kr is ta l l i sat ionen bis zur Konstanz der spezif ischen Rad ioakt iv i t / i t l ieferten ein nach Schmelzpunkt und pap ierchromatograph ischem Ver- ha l ten reines DHA. As-Pregnenolon-Tcc-aH (spezi~[ische Akt iv i t i i t : 739.749 ipm/y) stel l ten wir nach GUT und UsKoKovi~ x0 durch spe- zifische Tr i t i ierung des 7e-Brom-Der ivates her und rei- n igten es kurz vor Gebrauch durch Verdt innen mi t A 5- Pregneno lon und Umkristal l is ieren. In fester Form war dieses Pr / tparat n ieht lange ha l tbar (Radiolyse). Das nach der WlLzmACa-MethodeXZ bereitete und nach SOLOMON et al. 12 gereinigte tr i t i ierte 17e-Hydroxy-A~-pregnenolon - acetat besass eine spezif ische Akt iv i t i i t yon 21.448 ipm/7 und das daraus durch Chroms/ iureoxydat ion gewonnene DHA-Acetat eine solche yon 18.720 ipm/y. Die Messungen wurden in e inem ~Tri-Carb~-Fl i issigkeits-Szinti l lat ionS- Spekt rometer (Packard, Inst . Comp. Inc.) ausgeff ihrt xa und die Ausbeuten unter Ber i icks icht igung des zugesetz- ten Tr i igermater ia ls nach den t ibl ichen Formeln berechnet . VVie in der Tabel le angegeben, konnte in den Inkuba- t ions-Ans/ i tzen mi t tota len oder I rakt ion ier ten (L bzw. R) Nehennieren- oder Testes -Homogenaten ohne Zusatz yon Stero iden keines der be iden gesuchten A~-Steroide nach- gewiesen werden. Die h ier nur teilweise aufgeff ihrten Vor- versuche mit Steroiden haben ergeben, dass unter unseren Versuchsbed ingungen im Fal le yon Nebenn ieren-Homo- genat die 17a-Hy.droxyl ierung besser mi t der f iberstehen- den L6sung (L) und der Se i tenket tenabbau besser mi t dem Geweber i ickstand (R) durchf f ihrbar ist. Im Fal l des Hodengewebes verl ieI die 17~-Hydroxyl ierung mi t der F rakt ion L mindestens ebenso gut wie mi t dem tota len Homogenat , wogegen die Se i tenkette stets mi t le tzterem besser abgebaut wurde als mi t j eder der be iden F rakt ionen allein ~. Alle Umsetzungen verl iefen bei e inem pH yon 7-7,5 besser als bei e inem hSheren pH. Wie aus der Tabel le ersichtl ich, gelang es sowohl mi t normalem Nebennieren- wie Hodengewebe des R indes einerseits A~-Pregnenolonin 17u-Hydroxy-A ~-pregnenolon, andersei ts letzteres in DHA i iberzuff ihren. Die Ausbeuten waren teilweise so gering, dass zur Best / i t igung der Um- setzungen Tr i t ium-mark ie r te Subst ra te herangezogen wurden. Aus technischen Grf inden wurden die inakt iven Tr i igersubstanzen n icht zu Beginn, sondern erst w/~hrend der Aufarbe i tung zugegeben, so dass die berei ts vor der Tr~gerrnater ia l -Zugabe e ingetretenen Ver luste (max. 30%) n icht bert icks icht igt werden konnten; die in der Tabel le wiedergegebenen Zahlen stel len somit M in imahver te dar. Verschiedene Neben- und Fo lge-Produkte wie Progeste- ton, 17x-Hydroxyprogesteron, Androstend ion, Testoste- ton und 1 lfl- sowie 21-hydroxyl ierte Der ivate, die ffir die Frageste l lung yon untergeordneter Bedeutung waren, ana- lys ierten wir n icht in al len F~llen. Diese in vitro nachgewiesenen Umwand lungen lassen sich in das komplet t ie r te Schema der Androgenbiosyn- these in Nebenn ieren und Testes gemi~ss F igur einftigen. Dami t sollen keine quant i ta t iven Angaben fiber die rela- t ive und offensicht l ich speziesabh/ingige ]3edeutung der einzelnen Wege in vivo gemacht werden. Nach den bisher lgen ana lyt i schen ]3efunden scheint die A s_ Steroid-Genese in normalen menschl ichen Nebenn ieren im wesentl ichen, nur bis zur Stufe des 17x-Hydroxy-A 5- pregnenolon zu gehe ~,7,1~, wAhrend sie bei neoplst ischer Entar tung of fenbar bevorzugt bis zum DHA und welter ver laufen kann 16, t L Im Vergleich dazu ist dieser Biosyn- in Nebenniemn und Testes in Nebennieren r----Acetat-- - - ghatesterin i -- ~zX- P~,~gnenolon Progestecon Sulxstanz S * / ~cWi~ol 17ct-OH-&s-pmgnenolOn ~17a-OH- I ' rogesteron / - Corfisan - - -~ - BOA- ~An~rostenclion - - ~.11~-OH-An6rostenO,on ' 1 Adrcnoateron ,, in Testes - - T~tosteron Biosynthese land Umwandlung der Androgene =-~, av Umwandlung von A~-Pregnenolon und 17-Hydroxy-AS-pregnenolon mit je 100 g Gewebehomogenat (Rind) Homogenat alas Neben- nieren total F r .R Fr .L Neben- nieren Fr .L Fr . R Hoden total Fr. :R Fr. L Hoden total Zugesetztes Steroid s AS-Pregnenolon An-Pregnenolon-7~-3H 17~-Hydroxy-A 5- pregnenolon 17~-Hydroxy-A ~- pregnenolon.3H b AS-Pregnenolon A ~,Pregnenolon-7c~-aH 17c~-Hydroxy-A 5- pregnenolon 17~-Hydroxy-AS- pregnenolon-aH b UmwaDdlungs- produkte in 7 17~- [ Hydroxy- [ AS_pregne. DHA nolon < 15 < 10 < 15 < 7 < 15 < 15 48-90 < 20 19 - - 15-20 - - 8 15. I. 1961 Brevi comunicazioni - Brief Reports 21 theseweg in Testesgewebe wohl durchweg yon untergeord- neter Bedeutung. Dass die Umsetzungen in der A~-Reihe in vitro mit Testesgewebe (Rind) t ro tzdem besser ver- laufen, stel l t abgesehen yon m6gl ichen Spezies-Unter- schieden nur einen sehe inbaren Widerspruch dar, da nur in Nebennieren, nich~ aber in Testes mi t s tarken Konkur - renzreakt ionen in Form der l l f l - und 21-Hydroxyl ie- rungen zu rechnen ist. Summary. The t rans format ion of AS-pregnenolone into 17~-hydroxy-A6-pregnenolone, and of the lat ter into DHA, is shown to occur in homogenates and fract ions thereof, both of bov ine adrenal and test ien lar tissue. The re lat ive signif icance of these react ions for the biogenesis of andro- gens in normal and neoplast ic t issue is discussed. F. V~ 7. KAHNT, R. NEHER, K. SCHMID und A. WETTSTEIN Forschungslaboratorien der C I BA A htiengesellscha/t, Basel, 17. Oktober 1960. Zur Frage des pH-Optimums des Pepsins Es s teht lest, dass die synthet i sch hergeste l l ten soge- nannten Pept idsubst ra te pH-Opt ima der Peps inwi rkung aufweisen, die im schwach sauren Gebiet um pH 4 liegen, Im Gegensatz hierzu her rscht noch weiterh in die Meinung vor, dass nat i i r l iche Prote ine durchweg am besten zwischen pH 1,5-2 angegri f fen werden. CHRISTENSEN 1 f inder, dass sich bei denatur ie r ten Prote inen das Opt imum in das Ge- bier yon pH 2-4 verschiebt , was er Itir f l -Lactoglobulin, H~moglob in und Casein nachweist . Wi t hubert zur Prf i fung des Wirkungsbere iches des Pepsins 11 verschiedene zum Teil kr istal l ine, zum Teil nat ive Prote ine untersucht , indem wir den Subst ra t - schwund bei versch iedenem pH im Ze i tab lauf verfolgten. Urn den kathept i schen Effekt, der in wenig gerein igten PriLparaten yon Peps in zu beobachten ist, auszuschl iessen, haben wir unser Enzym mehr fach umkristal l is iert . Methodik Enzym. 5real umkristal l is iertes Peps in nach Northrop. Methode. Analog der Edest inmethode yon Bucns ~ Trii- bungsmessung auch ftir andere Proteine. Diese miissen 16slich sein, und ihre isoetektrische Zone dar f n icht in den Messbereich fallen, noch di ir fen andere F lockungen vor sich gehen. Aus diesem Grunde kann Casein n icht unter - sucht werden, dessen F lockung dutch Peps in bis gegen pH 2,7 vor sich geht. Herhun[t des Materials. Peps in kristaUisiert yon Wor th - ington (Freehold, N. J.). Aven in nach Osborne selbst dar- gestellt. Gl iadin, Edest in , Zein, kr istal l is iertes Ova lbumin, kr istal l is iertes H~imoglobin {Rind) yon Nutr i t . Biochem. C. {Cleveland, Ohio). F ibr inogen, Thrombin yon Hoff- mann-La Roche {Basel). Paracaseine siehe Text. Messinstrument. Photometer Eppendorf . Da die E ich- kurven der Subst ra te als gekr i immte Kurven vef laufen, Verziehteten wir auf Wiedergabe der Subst ra tkonzent ra - t ionen und dr i icken die Messungen in Skalentei len aus (Ablesungswert zum angegebenen Ze i tpunkt abzfigl ich Anfangsablesung). Die Verl~ufe, besonders die Opt ima, s ind auch so gut erkennbar . Ansiitze. Stets 1 mg Enzym gegeniiber 20-30 mg Sub- s t rut in e inem Vo lumen yon 6 ml, Puf ferung durchweg mi t Glykokoll-Salzs~ture 0.1 M. Pro lamine wurden mitte ls der A lkoho lmethode in L6sung gebracht a. Versuchsresuttate I. Edeslin pH-VCerte 1.79 2.60 3.08 3,30 3.53 4.00 Nach 2 min 14.3 11.7 g5.0 5.5 5.0 0.5 5 min 51.0 84.5 91.7 8,2 7.9 3.2 10 min 84.2 93.0 94.5 15.8 10,6 4.0 20 min 90.0 94.5 94.5 46.2 26,0 9.5 Ergebnis : Opt imum bei 3.08. 2. Gliadin pH-Werte 1.94 2.04 2.41 3.34 3.85 Nach 2 min 50.1 59.9 54.7 18.5 17,6 5 min 73.2 67.0 65.1 53.0 26.5 10 min 78.3 63.1 77.9 63.0 44.5 20 min 78.9 71,9 70,9 66.0 63.0 Ergebnis : Opt imum bei 1.94, 3. Avenin pH-Werte 1.87 2.36 2.58 3.46 3.55 3.85 Nach 2 min 26,2 11.1 8.6 5.5 11.4 10.5 5 min 59,6 37.7 20,3 7.8 16,9 17.3 10 min 71.4 57.1 44.1 16.8 18,0 22.5 20 min 71.3 60.2 50.3 32.0 32,2 27.7 Ergebnis : Opt imum bei 1.87. Wi rkungsabnahme nach rechts schnel ler als bei Gl iadin. 4. Zein pH-\erte 1.91 2.12 2.58 3,06 3.25 3.53 Nach 2 rain 15.1 13.0 18.1 flockt flockt flockt 5 min 33,9 31.1 29.4 flockt flockt flockt 10 rain 47.2 56.8 46.1 flockt flockt flockt 20 rain 63,2 69.9 53.0 flockt flockt flockt Ergebnis : Opt imum bei 1.91-2.12. 5. Ovalbumin, nicht kr istal l is iert ph-grert 1.90 2.46 2.54 2.95 3,28 3.79 3.92 Nach 2 min 76.9 16.8 14.0 10.5 9.0 30.2 9.0 5 min 33.4 22.0 14.0 16.7 18.2 32.9 18.2 10 rain 37.3 24.5 15.2 24.7 20.3 31.8 20.3 20 rain dL9 28.4 16.1 26.9 21.0 47.6 21.0 Ergebnis : Zwei Opt ima, bei 1,90 und bei 3.79!! Die Papiere lektrophorese ergibt, dass A lbumin im chemisehen Sinne nur 45.4% des Pr~iparates ausmacht ; es sind zwei Gipfel der Cona lbumine vorhanden und das P la teau des Ovomucoides. 6. Ovalbumin, kr istal l is iert pH-Werte 1.78 2,06 2.46 3.09 3.22 3.76 Nach 2 min 7.3 79.8 8,0 9.0 9.7 8,9 5 rain 14.8 32.9 13.2 8.5 16.2 9.0 10 rain 55,5 34,6 13.5 14.0 17.1 10.1 20 rain 58,0 36,8 14.2 15.9 16.7 15.2 Ergebnis : Opt imum bei 1.78-2.06. Das zweite Opt imum des vor igen Versuches entfi i l lt. Die Papiere lektrophorese ergibt, dass 85.1% des Subst rates A lbumin sind, 7. Fibrinogen pH-Werte 1.64 2.28 2.93 3.25 3.73 Nach 2 rain 13.9 18.3 24.ff 13.5 8.9 5 min 42.2 48.5 48.1 28.0 19.4 10 min 48.0 55,0 58.9 44.2 20.0 20 rain 50.6 56.6 60.1 52.9 34.9, Ergebnis : Opt imum bei 2.93, x L. K, CItRISTENSEN, Arch. Biochem. Biophys. 57, 163 (1955). 2 S, BucKs, Die Biologic des Magenkathepsins (Karger, Basel 1947). 3 E. BERGER und E. FREUDENBERG, Med. exp. 3, im Druck (1961).

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