Aspecte Genetice in Apoptoza

  • Published on
    26-Jan-2016

  • View
    223

  • Download
    6

DESCRIPTION

lucrare de diplomaAspecte Genetice in Apoptoza

Transcript

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

1. Introducere

1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei

Moartea celular este un element necesar n decursul vieii unui organism multicelular, ndeplinind numeroase funcii.

Prima descriere a apoptozei n decursul dezvoltrii embrionare a fost realizat de Vogt1 n 1842, iar primul studiu integrativ care a propus conceptul de apoptoz a fost realizat de ctre Kerr2 n 1972, care a observat recurena fenomenului n timpul proliferrii celulare sau n situaii patologice.

Numeroi cercettori au propus termeni diferii pentru a descrie fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliz, cromatoliz, sinucidere celular (vezi Majno i Jolis, 1995)3, fapt care se datoreaz modelelor diferite de cercetare.

Dac nainte de precizarea terminologic termenul de necroz era utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte celular, astzi el este folosit cu un coninut limitat la dezintegrarea pasiv a celulei, diferit de distrugerea voluntar, programat a acesteia. Pe parcursul acestei lucrri voi folosi termenul de moarte celular programat (MCP) ca fiind similar celui de apoptoz.

Analiza in vivo diferitelor tipuri de moarte celular non-necrotic a artat existena unor trsturi comune, indiferent de originea celulei sau stimulul utilizat.

Cu toate acestea, studiile in vitro au evideniat diferene n expresia proceselor sau inexistena unor trsturi tipice n anumite cazuri. De pild, utilizarea staurosporinei pentru a induce apoptoz genereaz distrugerea celulei fr formarea corpilor apoptotici, probabil datorit aciunii inhibitorii asupra unor kinaze implicate n apoptoza normal .4De asemenea, metamorfoza insectelor difer n anumite privine de tipul descris ca universal 5, iar n anumite cazuri cnd apoptoza este genetic imposibil, distrugerea capt o expresie diferit 6.

1.2 Necroza vs. Apoptoza

Despre diferenele dintre necroz i apoptoz pn s-a scris o literatura bogata, accentundu-se caracterul voluntar, controlat i dinamic al apoptozei, sau diferenele morfologice caracteristice fiecrui proces n parte. 1

Exist ns unele procese ce mprtesc cu apoptoza multe trsturi dar crora le lipsesc altele caracteristice acesteia, sau care ncalc modelul descris ca fiind tipic. 2S-a observat recurena necrozei n urma acelor procese de leziune celular brutal, cum ar fi atacul a numeroi ageni fizici sau chimici, hipoxia, toxinele, infeciile, fiind acceptat rolul necrozei n rspunsul generat la adresa unor ageni patogeni i importana procesului imflamator. 3Unele dintre elementele necrotice distinctive sunt scderea ATP citosolic, datorit creterii permeabilitii membranare, disfuncia unor canale cationice, degradarea fosfolipidelor i creterea calciului intracitoplasmatic. 4

Are loc prin urmare dilatarea reticulului endoplasmatic, degradarea membranelor mitocondriale i modificarea activitii translaionale.

n a doua faz necrotic se declanaz o degradare accentuat a membranelor celulare i a organitelor, hidratarea mitocondriilor i apariia unor agregate dense i bogate n lipide.

Dac n apoptoz celula n restrnge n mod treptat volumul, n necroz are loc un proces invers; cromatina apare agregat haotic, fiind mprtiat aleatoriu. 5 Celulele devin eozinofile, iar citoplasma este vacuolizat; degradarea final a organitelor nu este urmat de apariia unor structuri similare corpilor apoptotici.

n apoptoz, modificarea volumului celular se realizeaz prin pierderea de ap i ioni, nu ns i de macromolecule, membranele rmnnd relativ intacte; apar cute 6 la suprafaa plasmalemal, iar organitele rmn nedigerate pn la final. Condensarea cromatinei este ordonat, are loc fragmentarea i condensarea sa n mase compacte distincte la nivelul laminei celulare.

Caracteristica definitorie este fr ndoial formarea corpilor apoptotici i activarea programului fagocitar, ceea ce nu declanaz inflamaia.

Procesul apoptotic este controlat genetic, n etape distincte, fiind declanat ireversibil dup depirea unui punct critic 7, iar sinteza proteic nu cunoate un moment similar celui catastrofic necrotic. n acest caz sunt activate endonucleazele (calciu i magneziu dependente i care sunt inhibate de ctre Zn) care fragmenteaz ADN la nivelul fragmentelor linker, rezultnd fragmente de 180 200 perechi de baze 8.

La celulele anucleate apoptoza urmeaz acelai scenariu, chiar n absena degradrii nucleare.

Apoptoza necesit sinteza unor proteine cu rol apoptotic i ca urmare nu se produce o dezorganizare rapid a procesului.

Recent s-a descoperit c procesul sintetic este inhibat prin distrugerea factorului 4G eucariotic 9, ceea ce nu afecteaz sinteza proteinelor cu funcie prooncogen de tip c myc care necesit un segment intern de ataare ribozomal (IRES) localizat la segmentul 5 reglator.

Pentru a sintetiza, apoptoza este caracterizat de urmtoarele trsturi: 101. membranele plasmatice rmn intacte, formnd ns cute;

2. reducerea volumului celular ;

3. condensarea cromatinei la periferia nucleului, ce devine picnotic;

4. fragmentarea ADN si a nucleului;

5. distrugerea structurilor membranare;

6. vacuolizarea citoplasmei;

7. formarea corpilor apoptotici.

1.3 Funciile apoptozei

Acest proces nu este numai unul de curare, ci i unul de construcie, avnd un rol hotrtor n dezvoltare.

Apoptoza intervine n modelarea unor structuri (formarea unor caviti) 1, eliminarea celulelor redundante (neuronii motori ai vertebratelor), sau n turnover-ul tisular normal. 2De asemenea, apoptoza are o funcie esenial n meninerea homeostaziei tisulare, cum ar fi cazul hematopoiezei, meninnd un echilibru ntre proliferare i eliminare. 3Prin apoptoz sunt ndeprtate celulele sistemului imunitar care recunosc antigenele self, celulele imunitare activate inutile, clonele care genereaz anticorpi anti-self, si celulele T care nu recunosc CMH sau cele cu mare afinitate pentru antigenele self. 4Limfocitele T pot fi distruse n manier Fas-independent sau Fas-dependent.

Apoptoza reprezint un mecanism fundamental de protecie a organismului n cazul infeciei virale, cnd mecanismul de atac preferat al virusurilor este sinteza proteinelor cu funcie antiapoptotic, cum ar fi LPM 1 sau LPM 2, n cazul virusului Epstein Barr 5, sau proteina Tat care blocheaz apoptoza, n urma infeciei cu HIV 6.

Alteori virusurile modific proteina cu rol proapoptotic, pentru a favoriza diseminarea.

La fel se ntmpl n cazul infeciilor bacteriene, ns n timp de virusurile au mecanisme eficiente de inhibare a apoptozei pentru a iniia propria replicare, bacteriile au nevoie de supravieuirea celulelor infectate.

Apoptoza este necesar i n procesul de eliminare a celulelor cu rol imflamator, dup ndeplinirea funciei. 7Mecanismele apoptotice nefunctionale duc la apariia tumorilor, dar, dat fiind importana procesului, o vom trata ntr-un capitol separat. 8Apoptoza este implicat n numeroase maladii dintre care citm :

A) Boli neurodegenerative: Alzheimer, Parkinson, scleroz lateral amiotrofic, degenerescen cerebral;

B) Sindrom mielodisplazic;

C) Infarct miocardic.

1.4 Trsturi generale ale apoptozei

1.4.1 Apoptoza n cazul celulelor nucleate.

Putem clasifica trsturile apoptozei n eseniale i neeseniale. Cea mai importan trstur a celui de-al doilea tip este modificarea de la nivelul nucleului, deoarece apoptoza are loc n aceeai form i n celulele anucleate (Jacobson, 1994, Osthoff, 1994)1. Asemenea trsturi sunt clasificate ca postmortem, putnd fi absente n anumite cazuri, i au loc dup punctul de nentoarcere (point of no return).

n 1966 Tata2 a observat faptul c apoptoza necesit ARN i sintez proteic, ceea ce a subliniat faptul c acest proces este unul activ, dinamic, iar recurenta unor trsturi comune a generat speculaia c procesul apoptozei este reprezentat de catre o cale biochimic unic 3 fapt ce a fost ntrit de descoperirea existenei acelorai principii de organizare si n cazul C. elegans i al omului.

Dar faptul care a generat o teorie unificat despre apoptoz a fost descoperirea caspazelor, care au fost identificate n toate organismele, mai puin n drojdii, fiind identificate insa i unele mecanisme apoptotice ce nu necesit existena lor.

Ipoteza original a fost aceea c apoptoza const in primul rand n distrugerea citoscheletului de ctre caspaz, ceea ce a fost infirmat ulterior. (Martin 1995) .41.4.2 Dinamica citoplasmatic

Schimbrile sunt predominant biochimice, nu morfologice, cu excepia dispariiei microvililor ce are loc n urma activrii caspazelor i concomitent cu defosforilarea ezrinelor si a radixinelor care stabilizeaz microvilii prin interaciunea cu actina.

Schimbrile plasmatice cele mai evidente sunt datorate semnalelor fagocitice adresate celulelor nconjurtoare, ceea ce va activa ultima etap a apoptozei. 51.4.3 Schimbri la nivelul formei i structurii

n timpul apoptozei, celula i modific forma, distrugnd relaiile cu vecinii, iar la suprafaa membranei apar anumite cute (blebs) precednd formarea corpilor apoptotici.

La nivelul citoplasmei apar uneori vacuole, proces ce urmeaz distrugerii citoscheletului, in distrugerea acestuia un eveniment fundamental constituiindu-l activarea caspazelor, care distrug direct gelsolina, fodrina, actina sau Gas 2 (Kotha-Kota, Martin, Mashima). 6La soarecii knok-out pentru caspaza 3 apoptoza hepatocitelor i timocitelor prezint o formare mai redus a cutelor, lucru observat i n cazul unei linii celulare derivate dintr-un cancer mamar uman. Dac tratm celulele cu proteinaz K, cutele se formeaz n mod normal, iar adugarea inhibitorilor caspazici anihileaz aceast formare, ceea ce evideniaz rolul caspazelor.

Distrugerea citoscheletului 7 nu e haotic, ci organizat, ea necesitnd actina, care formeaz o structur asemntoare unui cerc la periferie, i gelsolina modificat, soarecii K.O. pentru gelsolin avnd o formare mai ntrziat a cutelor.

Odat declanat de activarea caspazei 3 formarea acestora e inevitabil, chiar dac sunt adugai inhibitori caspazici.

La nivelul miozinei au loc fosforilri pa lanul uor de ctre MLCK (miosin light chain kinase), care determin o nou interacie actin lanul uor al miozinei. 8Reorganizarea citoscheletului necesit numeroase kinaze: MAP kinaza ce fosforileaz hs27 1, (II). Pak 2 ce activeaz p 21, n urma actiunii caspazelor (III). SLK, Ste-20 kinaza, care e clivat de caspaza 3 i care rearanjeaz citoscheletul. Pak 2 e implicat n formarea corpilor apoptotici, iar din moment ce acest proces este inhibat de citocalasina B, probabil ca e implicat i actina F.

Apariia vacuolelor depinde de activarea caspazelor, o protein implicat fiind rabaptina 5 care afecteaz membrana celular.91.4.4 Schimbri la nivelul organitelor citoplasmatice

Distrugerea acetora este tardiv, schimbri mai pronunate aprnd la nivelul RE 10 care se dilat i pierde ribozomii ataai, iar proteina integral Bap 31 de leag de Bcl 2 i pro-caspaza 9, fiiind distrusa de ctre caspaze. Clivarea rabaptinei 5 va afecta fuziunea endozomilor i va dezorganiza metabolismul. Daca sunt translocate caspaze sau numai factori activati de catre acestea ramane de stabilit, in prezent ambele tabere avand argumente pro si contra.

Clivarea laminelor A i B are loc la nceput, ns caspazele nu distrug proteinele direct , ci prin intermediul altor molecule care au funcie special n apoptoz. 11Distrugerea ADN se realizeaz la nivelul unor segmente 200 300 Kpb, iar proteinele numite ICAD/CAD/DFF45/DFF 40 au un rol important n fragmentare, existnd n form inactiv ca dimeri, DFF 40 fiind complexat de DFF 45 protein chapperone. 12DFF 45 e clivat de ctre caspaz i e eliberat DFF 40 care realizeaz tieturi dublu catenare, mai ales in segmentul de legtur dintre nucleosomi.

oarecii trasgenici cu defecte n CAD au o fragmentare incoerent, iar tratamentul celulelor cu caspaz duce la condensarea cromatinei dar procesul e inhibat in urma tratamenului cu DFF 45.

Recent a fost izolat o protein numit Acinus 13 care e activat de ctre caspaz i care induce fagocitoza corpilor apoptotici si acest lucru se realizeaz att in cazul fagocitelor ct i in cel al celulelor nespecializate (de exemplu celulele epiteliale).

Distrugerea celulei se face pe o cale lizozomal n primul rnd n celula apoptotic prin autofagie, fiind descris o protein beclina, care se leag de Bcl 2 i e implicat n fagocitoz.14Alteori corpii apoptotici sunt digerai de ctre celulele vecine pe cale lizozomal.

1.4.5. Mitocondria

Dincolo de funcia apoptotic a mitocondriei datorit Bcl 2, unele modificri apar la nivelul membranei externe care e rupt n urma umflrii matrixului, ulterior aprnd fenomenul de condensare.15 Exist momentan o dezbatere privind implicarea mitocondriei n apoptoz, ideea acceptat de catre majoritatea comuniatii stiintifice a primatului ei n activarea caspazelor fiind contestat de actre o minoritate cu solide argumente in spate. Li Hu de la Burnham Institute a identificat un tip de receptor nuclear care prsete nucleul i intr n mitocondrie, elibernd citocromul c.

A. Marchenko (Stony Brook) a identificat un mecanism similar n cazul p 53, care se poate localiza la nivelul mitocondriei genernd o apoptoz mai rapid.

Alii au subliniat influenele tipurilor de modele de cercetare asupra rezultatelor, studiile pe C. elegans sugernd o activare caspazic independent de modificarea permeabilitii mitocondriale.

H. Steller a artat c p 53, un inhibitor caspazic al unor virusuri, previne apoptoza n retina unor insecte au o structur asemntoare retinis pigmentosa, ceea ce susine ideea aciunii caspazelor naintea aciunii mitocondriei.

1.4.6 Nucleul

Trstura iniial o constituie condensarea periferica a cromatinei, iar ulterior apare fragmentarea nucleului i dezintegrarea sa datorit degradrii ADN i a proteinelor nucleare. 16Caspazele 3 i 6 atac proteinele nucleare, cum ar fi lamine, proteinele scaffold, si DFF 45 ( Inhibitor DNA fragmentating factor/ ICAD).

Nucleul este distrus i integrat n corpii apoptotici; un alt factor implicat n apoptoz, AIF, declaaz apoptoza independent de caspaze i determin condensarea parial a cromatinei.

1.4.7 Reglarea volumului celular

Acesta nu este un mecanism pasiv, 17 pierderea volumului celular din timpul apoptozei n opoziie cu mecanismul necrotic de umplere, unde membrana plasmatic este rupt datorit pierderii timpurii de ATP care oprete transportul ionic, fiind controlata. Ruperea membranei plasmatice i eliberarea coninutului celular duce la un rspuns inflamator, n timp ce apoptoza este acompaniat de scderea volumului celular i meninerea integritii organitelor, iar integritatea plasmalemei se menine pn la sfrit. 18Celula a dezvoltat mecanisme reglatorii prin utilizarea canalelor ionice, transportorilor i reorganizarea citoscheletului pentru a menine ciclul celular.

La mamifere rinichii joac rolul de filtru ionic, ns datorit modificrii biochimice celulele trebuie s-i ajusteze singure volumul prin mecanisme de mrire (RVI) sau scdere (RVD) a volumului.

Principalii ioni sunt K+, Na+, Cl-, H+, HCO3-, iar elemetele implicate in mentinerea nivelului osmotic includ aminoacizi, CH3 NH2, polioli, zaharuri i uree (ONeill, 1999 ).19Canalele ionice sunt extrem de permeabile la ap, iar transportul ei depinde de concentraia ionic a aminoacizilor. Celulele n mediu hipertonic sufer procesul de pierdere de ap, ns existena RVI permite supravieuirea, prin activarea transportorilor electroneutri precum Na+/ H+ i cotransportorul Na+/K+/2Cl-, si prin schimbri n mecanismul de fosforilare.

Antiporterul produce un influx de NaCl i ap, fiind cuplat cu antiporterul Cl-/HCO3-, iar creterea sodiului intracelular duce la activarea Na+/K+ ATP-azei, ceea ce duce la existena unui gradient electrochimic prin meninerea unei concentraii sczute de sodiu i clor.

Celulele limfatice rareori apeleaz la RVI i nu i refac volumul.

Celulele n medii hipotonice i activeaz RVD i sunt cuplate cu o pierdere intracelular de potasiu, sodiu i clor, si cu expulzarea apei din celul. Expulzarea potasiului i clorului duce la reducerea volumului celular, iar o concentraie mare de potasiu inhib RVD.

Exist de asemenea i alte mecanisme de reglaj prin intermediul unor molecule sau transportori.

2. Etapele apoptozei

I. Faza iniiatoare

Cuplarea liganzilor la receptori, alterarea semnalizrii prosupravieuire din partea celulelor vecine sau incapacitatea reparrii ADN duc la declanare apoptozei.1 Pentru un organism unicelular singura ans de a supravieui este reapararea ADN lezat. La pluricelulare strategia este mai complex, implicnd blocarea ciclului celular sau a creterii i apoptoza.

n cazul reparrii ADN celula trebuie s decid dac materialul genetic a fost corect reparat sau nu. Dac nu, are loc blocarea ciclului celular pn la repararea ADN, sau se declanaz distrugerea prin apoptoz sau moarte replicativ.2 II. Faza de decizieTransducia mesajului apoptotic prin intermediul mesagerilor (ceramid, DAG, IP3, kinaze) duce la activarea genelor apoptotice, mai ales a celor bcl 2 sau ice.

Odat declanat, procesul este ireversibil. 3III. Faza de execuie

Enzimele de tipul caspazelor sau factorii de genul AIF au rolul de a degrada n mod direct organitele sau de a activa alte molecule cu rol efector.

Activarea endonucleazelor duce la degradarea ADN.4

IV. Faza de fagocitare

Corpii apoptotici sunt digerai de ctre celulele vecine sau de ctre celulele specializate, n urma semnalizrii profagocitare a celulei apoptotice.

n fagocitoz un rol fundamental l au trombospondina, fosfatidilserina i NANA. 5 3. Elemente implicate in apoptoza3.1 Receptorii apoptoticiAtunci cnd celulele sunt lipsite de semnale extracelulare de supravieuire, se declanaz apoptoza. Aceste semnale sunt produse de celule identice (tip autocrin) sau diferite (tip paracrin).

Adesea apoptoza poate fi indus de ctre molecule efectoare exprimate pe surafaa altor celule (NK) sau prin intermediul unor citokine. Receptorii apoptotici sunt receptori transmembranari care dup interaciunea cu ligandul transmit semnale apoptotice i fac parte din suprafamilia TNFR (tumor necrosis factor receptor) care posed domenii extracelulare bogate n cistein. 1De asemenea, receptorii apoptotici au o secven intracitoplasmatic numit domeniul morii2 (death domain) care face legtura cu ansamblul apoptotic intracelular care apare i la alte molecule cu funcie n semnalizarea apoptozei.

Cei mai bine caracterizai receptori sunt CD 95 (Fas sau Apo1) i TNFR 1 3(p 55 sau CD 120 a). Ali receptori apoptotici sunt CAR 1, DR 3, DR 4, DR 5, iar receptorul pentru p 75 NGF are i el un domeniu al morii.4

Liganzii care activeaz aceti receptori, cu excepia lui NGF, sunt molecule structural nrudite care aparin suprafamiliei TNF. CD 95 L se leag de CD 95, Apo 3 de DR 3, iar Apo 2 de DR 4 i DR 5. nc nu se cunoate ligandul pentru CAR 1.

a) CD 95

Fas este o protein transmembranar format din 325 de aminoacizi (48 KDa); captul aminoterminal este citoplasmatic, iar cel carboxiterminal este extracitoplasmatic.

Receptorii pentru Fas sunt repartizai variabil pe diferite celule, gsindu-se n numr mare pe timocite, hepatocite, miocard, ovar i pe suprafaa celulelor tumorale.

Este codificat de ctre o gen localizat pe braul lung al cromozomului 10 la om i 19 la oarece, ambele gene avnd 9 exoni.

Ligandul pentru Fas are un domeniu de aminoacizi hidrofil la mijloc i un segment carboxiterminal la exterior.

Regiunea extracelular are 150 de aminoacizi, fiind similar cu regiunile omoloage ale familiei TNF

Este codificat la om i oarece de o gen de pe cromozomul 1, avnd 5 exoni. CD 95 joac un rol fundamental n principal n trei tipuri de apoptoz: deleia periferic a celulelor T mature la sfritul unui rspuns imun; distrugerea unor celule infectate de virusuri sau a celulelor canceroase de ctre celulele cititoxice T i NK; distrugerea unor celule inflamate. Pacienii cu gene pentru CD 95 sau CD 95 L nefuncionale prezint o acumulare a celulelor limfoide periferice, care se manifest i n cazul unui sindrom autoimun fatal, caracterizat prin mrirea nodulilor limfatici. CD 95 i ligandul su sunt de asemenea implicai n anumite afeciuni ale sistemului imunitar.5

CD 95 L este o molecul homotrimeric, iar studiile de cristalografie sugereaz faptul c CD 95 L se leag de trei receptori CD 95.

Analizele RMN au sugerat o grupare (clustering) a domeniilor morii n urma interaciei acestora cu ligandul.6

TNFR 1

TNF este o citokin a crei funciei este distrugerea tumorilor, avnd un rol secundar n rspunsul inflamator i imunitar, acionnd pe limfocitele T, B, neutrofile, fibroblaste.

Induce de asemenea exprimarea moleculelor de adeziune mpreun cu IL 1.

TNF are dou forme, i , avnd o structur identic n proporie de 28 %, fiind codificate de dou gene diferite. TNF este codificat de ctre macrofage i are un efect citotoxic pe celulele tumorale, iar TNF este codificat de ctre TH.

TNFR 1 este unul dintre primii receptori utilizai n rspunsul inflamator, mediind secundar inflamarea unor structuri limfoide, cum ar fi foliculii primari ai limfocitelor B.

Nu toi membrii familiei TNF induc apoptoza dup cuplarea cu receptorul specific.

TNF este sintetizat mai ales de macrofagele active i de celulele T ca rspuns la infecie 7. TNF dup legare induce asocierea domeniilor morii, iar o protein adaptoare, TRADD (TNFR associated death domain), se leag prin propriul domeniu al morii de un domeniu al unui receptor.

TRADD funcioneaz ca o interfa receptor apoptoz, deoarece activeaz multe molecule semnal: TRAF 2 (TNFR associated factor 2) i RIP (receptor interacting protein) stimuleaz ci de semnalizare care duc la activarea NFKB i a JNK/AP 1 8, n timp ce FADD mediaz activarea apoptozei.

Numai RIP are o funcie intrinsec enzimatic, fiind o serin/treonin kinaz.

TRAF 2 i RIP activeaz NFKB (NIK) care n continuare activeaz kinaza factorului inhibitor (I KB) IKK 9.IKK fosforileaz I KB, ducnd la degradarea lui i permindu-i lui NF-KB s se deplaseze n nucleu. Calea de la TRAF 2 i RIP la JNK implic o cascad de evenimente care include MAP kinazele MEKK 1 (MAP/Erk kinaz kinaza 1).

MEKK 1 este asementoare cu NIK i este implicat deoarece mutanii MEKK 1 blocheaz activarea JNK de ctre TNF. MEKK 1 nu se leag de TRAF 2 sugernd faptul c o alt kinaz pentru TRAF 2 acioneaz nainte de MEKK 1. 10

Celulele din oareci knock-out pentru TRAF 2 sau din oareci transgenici ce au o mutaie TRAF 2 dominant negativ au numai un uor defect n rspunsul lor la TNF.

TRAF 2 s-ar putea s fie neesenial pentru activarea NF-KB prin TNF, sau ar putea exista un alt membru al familiei TRAF care se leag de TRADD i NK i se substituie lui TRAF 2.

TNFR 1 activeaz factorii transcripionali NF-KB i AP 1, ducnd la activarea unor gene proinflamatorii i imunomodulatorii.

TNF, spre deosebire de CD 95 L, declanaz apoptoza numai dac este blocat sinteza proteic, ceea ce sugereaz existena unor factori celulari care anuleaz semnalul apoptotic generat de ctre TNF.

Expresia acestor proteine supresoare se pare c este controlat prin intermediul NF-KB i JNK/AP 1.

TNF determin trimerizarea TNFR 1 dup legare, inducnd asocierea domeniilor morii.

DR 3

Acest receptor 11 este asemntor lui TNFR 1, ns in timp ce TNF este fucional mai ales n limfocite i macrofagele activate, ARNm pentru DR 3 este exprimat n mod constitutiv n multe esuturi.

Receptori Apo 2 L sau TRAIL 12 genereaz la fel ca CD 95 L apoptoza n multe celule canceroase, ns spre deosebire de ultimul, care este restrns la celule T i NK, ARNm pentru Apo 2 L se exprim n numeroase esuturi.

DR 3 are o similaritate cu TNFR 1, deoarece, la fel ca acesta din urm, activeaz NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP i apoptoza prin TRADD, FADD i caspaza 8. DR 3 se leag la Apo 3 L, care este legat structural de TNF.

Apo 3 L activeaz NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP i NIK i declanaz apoptoza prin TRADD i FADD.

Receptorii apoptotici pot fi utilizai n oncologie, deoarece au acces direct la caspaze i n plus iniiaz apoptoza independent de gena supresoare tumoral p 53 care este inactivat prin mutaie n 50 % din cazuri.

Domeniul morii al CD 95 interacioneaz cu FADD (Fas associated death domain) prin intermediul domeniului morii al acestuia din urm. FADD are un domeniu declanator al morii (death effector domain) care se leag la un domeniu analog repetat n tandem cu forma zimogen a caspazei 8 (numit FLICE sau MACH).

DED este un tip particular al unui domeniu de interacie homofilic numit CARD (caspaze recruitment domain), care exist n unele caspaze cu prodomenii mari (2, 8, 9, 10) 13.

Dup activarea lui FADD oligomerizarea caspazei 8 duce la activarea ei prin autoclivaj. Caspaza 8 activeaz alte caspaze efectorii , cum ar fi caspaza 9 - proteina mamalian omoloag lui CED 3- ducnd la apoptoz.

oarecii knock-out pentru FADD n celulele T au o sintez redus de celule T ca rspuns la stimularea antigenic, iar deleia FADD duce la moartea embrionilor 14.

3.2 Bcl 2

Este primul reglator mamalian care permite supravieuirea celulelor hematopoietice citokin-dependente, n absena citokinei 1, in etapa Go insa . Aceast descoperire a sugerat c supravieuirea i proliferarea celular sunt controlate de mecanisme genetice diferite. Bcl 2 nregistreaz diferite forme de leziuni celulare i decide dac celula trebuie s declaneze sau nu apoptoza. Anumite cai apoptotice, precum cele ce declansate de activarea receptorului apoptotic CD 95 evita acest nivel controlat de Bcl 2.

Pn acum au fost identificai cel puin 15 membri ai familiei Bcl 2 n celula mamalian, prezentnd cel puin unul dintre cele patru motive conservate cunoscute ca domeniile de omologie Bcl 2 (BH 1 BH 4) 2. Majoritatea claselor cu funcie antiapoptotic prezint cel puin BH1 i BH2, iar cei similari lui Bcl 2 au toate cele patru domenii (Bax, Bak, Bok, au BH 1, 2, 3 i sunt strns nrudii cu Bcl 2). Mai exist de asemenea alte 7 tipuri de proteine nrudite cu Bcl 2 ce au numai un segment parial omolog cu BH 3 3 (9 16 aminoacizi), i care n mod normal posed o funcie apoptotic (EGL 1 de la C. elegans care se leag la CED 9). Bax, Bak i Bok au o asemnare puternic cu BH 1, 2, 3 din Bcl 2.

Proteinele pro- i antiapoptotice pot heterodimeriza i isi anihila reciproc funciile, iar mutageneza dirijat a segmentelor BH 1, 2, 3 influeneaz n mod clar dimerizarea, modelul fiind reprezentat de Bcl XL.

Conformaia BH 1, 2, 3 creaz un spaiu hidrofob la care segmentul BH 3 helix amfipatic se poate lega. Heterodimerizarea nu este esenial pentru supravieuire, dar este insa pentru apoptoz.

Bcl 2 rezid pe faa citoplasmatic a membranei mitocondriale externe, a reticulului endoplasmatic i a anvelopei nucleare i nregistreaz dinamica proceselor msurnd fluxul moleculelor mici sau al peptideor.

Experienele realizate pe C. elegans au sugerat c proteinele antiapoptotice inhib direct abilitatea CED 4 de a activa caspazele.

CED 9 i Bcl XL se pot lega de CED 4, care se leag la rndu-i de CED 3 i i stimuleaz activitatea.

Regiunea BH 4 a Bcl XL este esenial n activitatea antiapoptotic i interaciunea cu CED 4 i poate servi ca un locus de ataare direct pentru CED 4 i modula structura Bcl XL.

S-a descoperit recent c Bcl XL 4 se leag de poriunea asemntoare CED 4 din Apaf 1, n timp ce procaspaza 9 se leag de domeniul de recrutare caspazic NH2 teminal (CARD), i c Bcl XL poate inhiba asocierea lui Apaf 1 cu procaspaza 9 si ii inhib astfel activarea.

Bcl 2, direct sau indirect, previne eliberarea din mitocondrii a citocromului c care cu ATP poate schimba structura Apaf 1 i poate activa caspazele.

Structura lui Bcl XL (segmentele 5 i 6) se aseamn cu insertia membranar a toxinelor bacteriene, ducnd la ideea c factorii cu BH 1, 2 funcioneaz prin formarea de pori n membrane.

n timp ce proteinele proapoptotice antagonizeaz n mod direct cu proteinele antiapoptotice prin intermediul liganzilor de tip BH 3, grupul Bax poate distruge direct organitele , chiar n prezena inhibitorilor caspazei; expresia proteinelor asemntoare Bax poate ucide celulele, condensnd ADN i alternd membranele fr activarea caspazelor, prin formarea unor pori n membrane.

Familia Bcl 2 este reglat de ctre citokine, unele gene proapoptotice fiind induse de ctre acestea, iar bax este activat n cadrul rspunsului mediat de p 53.

n celulele hematopoietice stimulate de IL 3, Bad este fosforilat i produsul sechestrat n citosol, iar semnalul de la receptor pare a fi transmis de PI 3 kinaza prin kinaza Akt la Bad.

Bcl 2 poate fi activat prin fosforilarea Ser70 i inactivat prin fosforilare de ctre JNK.

Bcl 2 protejaz mpotriva unor atacuri citotoxice (radiaii , UV), dexametazona, staurosporina, dar nu impotriva apoptozei declansata de CD95.

Dac oarecii bcl 2 -/- se dezvolt normal pn la o anumit vrst, cei bcl x -/- mor in utero, iar cei bax -/- au celule T cu senzitivitate la iradieri; testele au artat c Bax este responsabil pentru moartea anormal n bcl x -/- i cea limfoid n bcl 2 -/-.

n condiii suboptimale, bcl 2 promoveaz intrarea n starea de neactivitate i ntrzie declanarea unui nou ciclu, iar acest efect este separat genetic de funcia de supravieuire, deoarece inhibarea ciclului celular nu inhib supravieuirea, care este afectat printr-o deleie ntr-o bucl neconservat, sau prin mutatie la nivelul tirozinei 28.

Inhibiia poate implica o protein care se leag la regiunea Bcl 2 , precum calcineurin fosfataza. Celulele T care exprim Bcl 2 sintetizeaz mai puin IL 2, citokin necesar intrrii n faza S, datorit translocrii nucleare reduse a NFAT, care cere calcineurina, pe care Bcl 2 o poate sechestra n membranele intracelulare.

Odat ce a fost descoperit funcia apoptotic a lui Bcl 2, a fost analizat i funcia sa n oncogenez.

n oarecii transgenici Bcl 2 se acumuleaz n exces celule B mature, iar limfoamele prezint adesea translocaii Myc.

Sinergia myc i bcl 2 a fost demonstrat n cazul limfoamelor si a cancerului mamar la oarecii bitransgenici.

Toate genele bcl 2 sunt potenial oncogenice, iar unele mutaii probabil mresc expresia n mod indirect. n celulele hematopoietice Myb, Ras, AML 1 ETO induc expresia bcl 2 iar fenomenul de supraexpresie este ntlnit n leucemia mieloid.

3.3 Mitocondria i apoptoza

Dei inhibarea caspazelor blocheaz apoptoza indus de etoposid, actinomicina D, UV, staurosporin, expresia c myc, glucocorticoizi, nu menine ns capacitatea replicativ a celulei. n cele din urm celula moare, pe o cale nonapoptotic, probabil necrotic. 1Proteinele antiapoptotice Bcl 2, Bcl XL i Abl pot menine capacitatea de supravieuire i multiplicare chiar n urma tratamentelor, iar Bax poate induce moartea celulei prin distrugerea mitocondriei chiar i n absena caspazelor. 2Exist cel puin trei mecanisme de atac:

1. distrugerea lanului transportor de electroni, a fosforilrii oxidative i producerii ATP;2. eliberarea proteinelor ce determin activarea caspazelor;33. alterarea potenialului redox. 41. Radiaiile induc apoptoza n timocite i distrug lanul transportor de electroni, probabil la nivelul citocrom b c 1 / citocrom c, prin intermediul unui ceramid care funcioneaz ca un mesager secundar , iar ataarea Fas duce la afectarea aceluiai transport la nivelul citocromului c.

O consecin a acestui mecanism este scderea concentraiei de ATP care are loc trziu n apoptoz, i probabil ca nu are o funcie esenial.

Importana mitocontriei n apoptoz a fost sugerat de ctre analizele sistemelor noncelulare, unde condensarea nuclear i fragmentarea ADN ce era inhibat de Bcl 2 era dependent de existena mitocondriei.

Eliberarea citocromului c n citosol este inhibat de ctre Bcl 2, aceasta facand parte din apoptozom , format n plus de Apaf 1 i procaspaza 9. 5Activarea ultimei duce la activarea celorlaltor tipuri caspazice, iar inhibitorii acestora nu previn eliberarea citocromului c indus de UV, staurosporin, Bax, dar o previn pe cea indusa de catre activarea Fas.

Consecina elliberrii citocromului c depinde de tipul celular, deoarece n acele celule unde citocromul c este n exces, caspazele sunt activate, i sufucient citocrom c rmne depozitat datorit afinitii ridicate pentru citocromii b c1, n acest caz consumul de oxigen i producia de ATP putand continua n timp ce caspazele i continu demersul.

Alternativ, n celulele ce conin cantiti mari de nhibitori ai caspazelor, eliberarea citocromului c poate eua n declanarea apoptozei i poate genera un mecanism necrotic.

Mitocondria elibereaz i ali mediatori apoptotici, cum ar fi procaspaza 3, AIF, care este blocat de ctre Z VAD Fmk, un inhibitor caspazic general. Un alt mecanism de distrugere l constituie generarea anionului superoxid 6 care crete n timpul apoptozei, ns implicarea exact nu a fost precis lmurit.

Distrugerea potenialului transmembranar se realizeaz prin intermediul unui por special, 7 format din proteine ale membranei interne (ANT) sau externe (porina) care funcioneaz sinergistic, la punctele de contact.

Deschiderea unui canal nonselectiv, n membrana intern genereaz un echilibru ionic ntre matrice i spaiul intermitocondrial, anulnd gradientul de H+ i genernd o modificare de volum datorit diferenei osmotice, ceea ce distruge membrana extern, elibernd proteinele activatoare ale caspazelor.

Blocanii formrii unui asemenea por (ciclosporinele i acidul bongkrekic ) anuleaz apoptoza, acelai efect avndu-le i Bcl 2.

Un alt mecanism de distrugere a membranei mitocondriale externe, implic hiperpolarizarea 8 membranei mitocondriale interne, datorit unui export de protoni ce protoneaz acizii slabi, care difuzeaz liber prin membrana intern, schimbnd osmolaritatea, mrind matricea mitocondrial i rupand membrana extern.

O alt legtur ntre apoptoz i fiziologia mitocondriei este sugerat de prezena proteinelor familiei Bcl 2 n membranele mitocondriale 9. Omologul Bel 2 din C. elegans CED 9 este tradus de pe un ARNm dicistronic care codific att pentru CED 9 ct i pentru citocromul b, ceea ce implic c CED 9 deriv din simbioni promitocondriali, i a fost transferat n genomul nuclear.

Membrii Bcl 2 sunt ancorai n membrana mitocondrial extern printr-un segment hidrofobic de aminoacizi, localizat la captul COOH, iar restul proteinei orientat spre citosol.

O mare varietate de evenimente mitocondriale depind de Bcl 2, ca de pild inhibarea eliberrii Ca2+ din matrix indus de decuplani ai respiraiei.

Proteinele Bcl XL sunt compuse din 7 helixuri legate prin bucle flexibile i au o mare asemnare cu domeniile formatoare de pori ale unor tipuri de toxine bacteriene (toxina difteric, colicina) 10.

Pot forma canale ionice, iar deleia helixurilor 5 i 6 duce la inexistena porilor. Bcl 2 regleaz o mare varietate de evenimente chiar n prezena unor inhibitori ai caspazelor (Z VAD Fmk) inhib nu numai apoptoza dependent de caspaze, ci i necroza indus de hipoxie , iar Bax induce eliberarea citocromului c i apariia apoptozei chiar la drojdii care nu au caspaze.

Dei implicarea mitocondrial i a citocromului c poate nu este universal, aceasta apare frecvent la eucariote. Pn acum nu a fost gsit o corelatie ntre citocromul c i apoptoza la nematode i insecte (la primele activarea caspazelor prin interaciunea cu CED 4 se realizeaz fr citocromul c).

3.4 Caspazele

Sunt o familie de cistein proteaze i au capacitatea de a distruge importante grupri proteice, proteoliza fiind un proces ireversibil.

Precursorii caspazelor nu au capacitate enzimatic, clivarea proteolitic transformndu-i n grupri active, aceasta realizndu-se prin intermediul altei proteaze sau prin autocataliz, datorita legrii unor cofactori sau al ndeprtrii unor inhibitori.

Reaciile proteolitice sunt de obicei specifice, aceasta fiind conferit de combinarea structurilor secundare i teriare ale substratului.

Odat cu descoperirea faptului c CED 3 1,2 , caspaz existent la nematodul Caenorhabditis elegans, este nrudit cu enzima transformatoare a interleukinei 1 (ICE, caspaza 1), a fost descoperit rolul apoptotic al acestei familii de proteaze, acestea avnd similariti n secvena de aminoacizi, structur i specificitatea de substrat.

Sunt sintetizate ca proenzime (30 50 KDa), au un domeniu aminoterminal cu rol reglator, o subunitate mare (20 KDa) i una mic (10 KDa), iar activitatea implic procesri proteolitice ntre domenii, urmat de ansamblarea subunitilor ntr-un heterodimer.

Prin cuplarea a doi dimeri rezult un tetramer cu dou situsuri active, cu funcionare independent. 3Domeniul aminoterminal, cu o dimensiune variabil, este implicat n reglare, iar activare presupune recunoaterea a cel puin patru aminoacizi la nivelul situsului de clivare, ceea ce este suficient.

Motivul de recunoatere prezint o diversitate la nivelul diferitelor caspaze, ceea ce explic probabil diversitatea funciilor. 4

Cu toate acestea, nu toate proteinele ce conin secvena de patru aminoacizi sunt clivate, ceea ce constituie un argument pentru importana structurilor tertiare i cuaternare.

Clivarea proteolitic nu numai c este specific, dar este i eficient ( kcat / Km > 106 M-1 S-1). Specificitatea extraordinar a caspazelor implic faptul c proteoliza este extrem de selectiv, iar trsturile fundamentale ale apoptozei (fragmentarea ADN, condensarea cromatinei, formarea corpilor apoptotici) nu pot fi nelese fr o aprofundare a mecanismelor de funcionare a caspazelor. Prima funcie a caspazelor este aceea de a inactiva proteinele care protejaz celulele vii de apoptoz. n timpul apoptozei, ICAD este inactivat de ctre caspaze, elibernd CAD 5. Pe de alt parte, CAD eliberat n absena inhibitorului nu este funcional, ceea ce argumenteaz n favoarea unor modificri cotranslaionale CAD - ICAD. 6Caspazele contribuie la apoptoz prin dezansamblarea structurilor celulare, precum lamina nuclear, format din polimeri ai filamentelor intermediare (laminele A, B, C) 7,8 . Caspazele cliveaz proteine implicate n formarea citoscheletului,cum ar fi gelsolina, FAK ( focal adhesion kinase ), sau PAK2 (kinaza 2 activata de p 21). 9 Un alt mecanism de aciune l reprezint dezansamblare multimerilor, prin atacarea n special a domeniilor reglatoare sau efectoare.

Strategia caspazelor const n ruperea legturilor celulei cu vecinii, dezorganizarea citoscheletului, afectarea replicrii i reparrii ADN, a splicing-ului, ruperea ADN, a membranei celulare, si in determinarea semnalizarea unor mesaje cu funcie n fagocitoz i formarea corpilor apoptotici.

Reglarea activitii caspazelor se realizeaz pe mai multe nivele.

Activarea caspazelor efectorii se realizeaz prin cascad, semnalul proapoptotic culminnd cu activarea unei caspaze cu funcie iniiatoare, care la rndul ei activeaz caspazele efectorii.

Exist mai multe tipuri de caspaze care mediaz seturi distincte de semnale, ca de exemplu caspaza 8 care este asociat cu receptorii apoptotici, n timp ce caspaza 9 este implicat n apoptoza indus de agenii citotoxici.10

Activarea caspazelor iniiatoare. Acest proces implic legarea unor cofactori specifici, fenomen declanat de un semnal proapoptotic ce rezid n dou motive structurale, unul n prodomeniul caspazei, iar cellalt n cofactor. 11

Activarea procaspazei 8 necesit ataarea FADD la DED, n timp ce procaspaza 9 necesit citocromul c i ATP, si legarea de CARD.

Modelul autoproteolitic descrie fenomenul prin preexistena unor precursori n celule cu o conformaie ce previne clivarea.

Cofactorii sunt similari n secven cu procaspaza 8, exceptnd faptul c le lipsesc fragmentele cu funcie catalitic. Aceste proteine competiioneaz cu procaspazele 8 pentru FADD, prevenind activarea caspazelor.

Un alt mecanism de reglaj l constituie compartimentalizarea, deoarece extracte din celul activeaz caspazele.

4. Proteine cu funcie adaptorieDup interacia receptor-ligand are loc cuplarea acestora cu proteine citoplasmatice care la rndul lor activeaz efectorii citoplasmatici.

Exist dou clase, prima cuprinznd TRADD, FADD, RIP, iar a doua TRAF 1, TRAF 2, TRAF 3.

TRADD 1 este asociat cu TNFR 1, are o mas de 32 KDa, i interacioneaz cu domeniul morii din receptor. Are un domeniu identic 25 % cu cel similar din receptor n zona carboxiterminal, zona aminoterminal fiind identic.

FADD se cupleaz cu domeniul morii din Fas, iar segmentul DED (domeniul apoptotic efector) se cupleaz cu segmentul omolog al caspazei 8.

RIP 2 este o alt molecul de 74 KDa care interacioneaz cu domeniul morii al lui Fas, fiind implicat ns i n inducerea NF-KB de TNFR 1. Fiind o serin/treonin kinaz, poate fi uor activat i pentru acest rol. RIP poate interaciona i cu TRADD i induce apoptoza.

RAIDD (RIP associated ICH 1/CED 3 homologous protein with death domain) este o alt molecul adaptor care este implicat n transmiterea semnalului apoptotic pe calea TNF, i posed un domeniu CARD omolog cu altul de pe procaspaza 2.

TRAF. Exist 6 tipuri de asemenea molecule, avnd n comun un segment de 150 de aminoacizi, implicat n interaciunea cu alte molecule.

TRAF se poate cupla i cu TRADD, fiind implicat aadar n semnalizarea TNF 1, iar TRAF 2 activeaz NF-KB printr-un mecanism nc necunoscut.

FLICE. 3Activarea adaptorilor duce la declanarea atacului caspazic.

Caspazele se gsesc n celule sub forme inactive, activarea realizndu-se n cascad. Proteinele FLICE (FADD-like ICE) au domenii de omologie cu FADD i cu ICE/CED 3 din clasa caspazelor.

Au dou lanuri aminoterminale de 60 de aminoacizi fiecare, avnd similaritate de 35 % cu domeniul morii din FADD. 4MACH. 5 Este omoloag cu CED 3, are o mas molecular de 34 KDa i este monomeric. Diferitele forme au segmentul carboxiterminal variabil, aici fiind localizate segmentele omoloage cu ICE/CED 3.

Regiunile omoloage au activitate proteazic de tip cazpaz i pot induce activarea acestora.

FLASH 6Au aceeai funcie de activare a caspazelor ca i cele de dinainte, avnd secvene similare cu domeniile morii ce se pot cupla cu regiuni omoloage din caspaze sau adaptor.7 5. AIF 1 Analiza mecanismelor apoptotice independente de apoptozom (citocrom c/Apaf 1/caspaza 9)a dus la nelegerea funciei factorului de inducere a apoptozei (AIF) localizat la fel ca i Bcl 2 n spaiul intermembranar mitocondrial.

Adiia AIF la sisteme nucleare acelulare declanaz trsturile tipice ale apoptozei, cum ar fi condensarea cromatinei i fragmentarea ADN.

Liniile celulare aif -/y (gena AIF este X likat) aveau o proliferare normal in vitro, i spre deosebire de citocrom c -/-, apaf -/-, caspaza 9 -/-, aveau o susceptibilitate normal la apoptoz n urma anulrii potenialului mitocondrial, tratamentului cu staurosporin, etopozida, azid, ultraviolete, anizomicin, lucru constatat chiar n prezena inhibitorului caspazic Z VAD-fmk.

Acest tip de apoptoz este necesar n decursul dezvoltrii embrionare, mai ales n momentul formrii cavitii amniotice, proces ce nu necesit funcionarea apoptozomului.

Calea este nc necunoscut.

6. ASPECTE GENTICE ALE APOPTOZEI7.p 53 si cancerul

Apoptoza reprezint ultima solutie pentru celula i este folosit mai ales n cazul celulelor care constituie un factor de risc neoplazic.

n procesele de rspuns la leziuni sunt implicate mai multe protein kinaze, nrudite cu PI 3 kinaza 1, cum sunt ATM, ce sufer mutaie n ataxia telangiectasia i DNA-PK 2, care are un rol important n recombinarea V(D)J i protejarea telomerelor.

Aceste dou protein kinaze sunt omoloage cu Rad 3/MEC 1 de la drojdii i sunt implicate n strategia rspunsului la distrugere. p 53 este eliberat de Mdm 2 datorit fosforilrii acestuia de ADN PK i prin PK activate de stress (SAPK/JNK), care este iniiat prin MEKK 1 i implic fosforilri secveniale i prin activarea cii SEK 1/ MEKK 4 sau SAPK/JAK i c Jun.

Proteina cu rol n supresia tumorii (p 53), este meninut n mod normal la un nivel sczut prin interacia cu Mdm 2 care este implicat n distrugerea sa.

Leziunile de la nivelul DNA induc fosforilarea p 53 sau Mdm 2 mpiedicnd interacia lor i activnd p 53. Aceasta este ineficient n numeroase cancere, iar Mdm 2 este amplificat n unele tumori. 3Concepia clasic era cea a alternativei: reparare ADN sau moarte pasiv. Datorit nelegerii funciei p 53, astzi tim c se poate alege n afar de reparare ntre blocarea ciclului celular i apoptoz.

Dac funcia p 53 in cadrul ciclului celular si blocarea lui a fost suficient studiat, rmne obscur insa relaia cu apoptoza.

Se tie c Bax, IGF-1, IGF-BP3 sunt proteine int ale p 53, dar nu se cunosc exact relaiile dintre ele. 4p 53 este implicat i n rspunsul celular la privare fizic, leziuni fizice, oc termic, hipoxie i expresia myc sau E1A. 5Prima protein cu funcie proapoptotic a fost c-myc, al crei transcript aparine clasei bHLH zip. Un posibil factor implicat n funcia apoptotic a c-myc este clasa cdk. 6Acstea sunt activate n apoptoza neuronilor nfometai, a limfocitelor tratate cu citocalasina B, TNF, FAS sau proteina Tat viral, si in diferenierea miocitelor.

E1A este principala protein oncogenic codificat de un adenovirus i la fel ca myc, este un inductor apoptotic.

O posibil interpretare a apoptozei indus de myc, E1A i E2F, este aceea c apare un conflict intre tendina de dezvoltare indus de oncogen i semnalele inhibitorii ale creterii, ceea ce face loc aciunii p 53.

n timpul infeciei virale, E1A determin acumularea de p53 care ar induce apoptoza dac nu ar fi proteinele clasei E1B, p 19 i p55 7. E1B 19 K este un omolog al lui Bcl-2, iar 55 K se leag de p 53 i l inactiveaz.

Apoptoza indus de oncogene poate sugera interdependena dintre sistemul apoptotic i cel al creterii celulare: prin modelul semnalizrii binare induce mesaje apoptotice care n mod normal sunt anihilate de ctre mesajele de supravieuire generate de ctre celelalte celule 8.

Relaia este reciproc deoarece n anumite circumstane anihilarea apoptozei induce oprirea proliferrii.

Dei expresia Bcl-2 oprete apoptoza, celulele afectate au probleme n continuarea ciclului celular 9 i, reciproc, Bax accelereaz acest proces 10.

Un exemplu interesant l constituie cazul oncoproteinei Ras care este un transductor normal al Raf-MAP K i al activrii PI 3 K, AK 1 sau Bcl, n urma cuplrii receptorului IGFI 11.

Mutaia oncogenic a lui Ras induce proliferarea celular i blocarea apoptozei, ns exprimarea sa n celulele netransformate duce la efecte contrarii, datorit Raf.

p 53

O trstur important a celulelor maligne o constituie proprietatea lor de a supravieui n condiii de instabilitate genomic ridicat, care este generat prin deleia senzorilor de distrugere, atenuarea semnalelor apoptotice i prin creterea semnalelor de supravieuire (citokine solubile, factori de cretere, contacte prin matricea celular).

Aproape 50 % din cazurile de cancer implic o deficien n funcionarea p 53.

Timocitele p 53 -/- nu intr n apoptoz, ns adiia de glucocorticoizi o induce, ceea ce indic existena cilor p 53 independente; de asemenea celulele bax -/- intr n apoptoza mediat de p 53.

p 53 este un factor de transcripie cu localizare nuclear; are un domeniu aminoterminal de activare i unul central de interaciune cu ADN la nivelul unor secvene consensus, majoritatea mutaiilor missense fiind localizate aici.

Are un turn-over rapid (20) i este meninut n stare inactiv prin interacie cu Mdm 2.

n urma leziunilor ADN p 53 este prelucrat posttranscripional, devenind astfel mai stabil. p 53 este esenial n cazul apoptozei folicoblastelor embrionare murine induse de E1A; de asemenea, activeaz p 21 prin inhibarea represorului. p 21 se leag la complexele cdk cicline care intervin n tranziia G1 / S i previne fosforilarea Rb, blocnd eliberarea E 2 (factori transcripionali) i implicit blocnd ciclul celular. p 21 se leag de asemenea la PCNA (factor al ADN polimerazei ) i inhib replicarea ADN.

4. NF-kB si apoptoza 1Citokinele TNF sau IL 2 induc translocaia NF-kB prin dislocarea de IkB, iar dup aceasta are loc inducerea transcripiei a numeroase gene care regleaz creterea celular, a unor receptori sau citokine.

Principala int o constituie genele IAP care n mod normal inhib apoptoza.

NFkB este un heteodimer uzual de 50 KDa, ns a mai fost identificat i o a doua form, de 65 de KDa.

Datorit activrii TNFR 1, NF-kB est activat, protejnd celula de intrarea n apoptoz, iar activarea A1 / BFI 1 determin inhibarea eliberrii citocromului c i blocarea activrii caspazei 3.

LMP 1 2 (proteina membranar a virusului Epstein Barr) simuleaz aciunea lui TNFR 1 prin legarea la TRAFs i TRADD i induce sinteza NF-KB.

7. MODIFICARI NUCLEARE IN APOPTOZADinamica nuclear este de obicei caracterizat ca fiind dominat de condensarea periferic a cromatinei, fragmentarea ADN i formarea unor corpi apoptotici care nglobeaz fragmente nucleare.

Cu toate acestea, apoptoza citoplasmatic decurge normal i n celulele care au mutaii n genele implicate n dezintegrarea nucleului i n cele anucleate.

n 1994 Schulze-Osthoff 1 a evideniat faptul c n celulele anucleate aparinnd liniei L 928 dintr-un fibrosarcom murin tratamentul cu citocalazina B induce apoptoza clasic, si ca absena fragmentrii nucleare nu blocheaz calea apoptotic mediat de Apo 1 / Fas.

Mai mult, inhibitorii endonucleazelor nu blocau apoptoza indus Apo 1 / Fas n celulele L 929.

TRASATURI STRUCTURALE

a) relatia condensare-apoptoza

S-a discutat mult timp despre relatia dintre condensarea cromatinei si fragmentarea ADN. Prima etap observabil este condensarea cromatinei la nivelul membranei celulare, ipotez sugerat de inelul dens ce apare n microscopia electronic2, condensare care cuprinde ntreg nucleul, ulterior acesta dezintegrndu-se i fiind nglobat n corpii apoptotici.

Caspazele 3 i 6 sunt implicate n activarea DFF 40 (CAD), clivarea PARP, laminelor i a factorilor de ataare la structuri scaffold. 3Clivarea laminelor are loc n urma activrii caspazei 6, iar mutanii cu lamine neclivabile A i B prezint o ntrziere apreciabil n ceea ce privete fragmentarea nuclear. Alte studii insa au demonstrat faptul ca unele celule incubate cu proteinaza K prezint o clivare a laminei B, lucru care nu este suficient totusi pentru a declana condensarea nuclear.

Ipoteza sugerata de alte studii este aceea c modificrile structurale nucleare nu necesit digestia proteinelor structurale, ultimul proces doar acompaniind evenimentul apoptotic, i c aceste schimbri se datoreaz unor factori apoptotici nucleari activai prin caspaze (exceptnd AIF). 4 Dupa asemenea studii clivarea caspazic nu este necesar n condensarea primar ns este esenial n separarea final a nucleului.

Mutanii care au lamine neclivabile erau rezistenti la proteoliz, fapt care afecteaza condensarea nuclear i distrugerea nucleului, care capata aspect convolut, nucleul suferind colapsul chiar n absena condensrii nucleare, proces care are loc i n urma inhibrii proteazelor laminare.

Exist trei posibile explicaii pentru a mpca observaiile uneori conflictuale. 5

1. Inhibarea clivrii laminare poate bloca detaarea ADN de lamin, care va colapsa n zona central.

2. Lamina neclivabila previne fragmentarea nuclear ca are loc n mod normal prin agregarea cromatinei n corpi apoptotici. 3. Distrugerea laminei faciliteaz apoptoza prin deschiderea nucleului i expunerea lui la factori citoplasmatici cu rol n activarea nucleazelor. a) fragmentarea ADN condensarea cromatinei

Aceasta are loc n etapa urmtoare la nivelul unor segmente de 30 50 Kpb i 200 300 Kpb.

Clivarea internucleozomal genereaz fragmente de ADN multipli ai lungimii lui n jurul nucleozomului, fiind inhibat de zinc, inhibare care insa nu afecteaz condensarea cromatinei.

Studiile lui Rao 6 pe celule infectate cu oncogena E1A au artat c dei n faza iniial are loc o accelerare a replicrii ADN, ulterior acumularea

p 53 induce apoptoza. Acest proces este inhibat de ctre E1B 19 K care este similar cu Bcl 2 i care probabil interacioneaz cu lamina nuclear.

Familia caspazic ICE recunoate i taie la nivelul unui aspartat n poziia P 1 a unei secvene consensus. PARP este clivat de asemenea la nivelul unui aspartat n secvena DEVDD.

Lamina A are dou situsuri, 230 i 446 n secvenele EVDNG i EIDSG, iar aspartatul 230 este conservat la om, oarece, pui, Xenopus, Drosophila.

Fragmente din laminele A/B/C la nivel 220 390 au fost generate ca proteine de fuziune cu GST (GST LA 220 390 / GST LB 220 390) i au fost purificate pe Sepharose, si s-a stabilit astfel ca substituia n P 1 a asparatului cu alanina genereaz mutani rezisteni la clivaj.

Extracte citoplasmatice din celule trasformate cu E1A i p 53 au fost blottate folosind anticorpi anti-GST i a fost evideniat o cretere a cantitii de fragmente raportat la timp.

Clivajul laminar se realizeaz la 32 C, dar nu la 38 C, ceea ce fundamenteaz implicarea p 53, insa nici un fragment nu a fost observat n celulele infestate cu E1B 19 K la 38 C sau 32 C, care previne de asemenea procesarea CPP 32 i clivarea PARP n linii CHO.

Inhibarea proteolizei laminare in vitro n urma tratamentului cu FLCK blocheaz modificrile nucleare, iar activarea nucleazelor este important n apoptoza nuclear, fragmentarea ADN acompaniind pierderea viabilitii n apoptoza indus E1A p 53 dependenta. Degradarea laminei B1 n timocite precede fragmentarea ADN, dar inhibarea cu TLCK nu blocheaz clivarea internucleozomal a ADN n sisteme noncelulare.

Mutanii deficieni n expresia laminelor au pierdut din viabilitate n 18 ore iar microscopul electronic a evideniat un nucleu cu lamin intact, cu un aspect inedit. n cele din urm nucleii au suferit un colaps i apoptoza a continuat normal.

CIDE N SI CIDE B

La vertebrate au fost descoperite dou noi familii de gene, Cide N i CIDE B 7, care codific pentru dou proteine omoloage segmentului aminoterminal de la DFF 45. Segmentul carboxiterminal al CIDE are un domeniu efector suficient degradrii ADN, iar segmentul aminoternimal are funcie reglatoare.

Sunt omoloage cu DFF 45, au un segment aminoterminal similar segmentului CIDE N din CAD care are funcie reglatorie, si un domeniu carboxiterminal killer (CIDE C).

n timp ce funcia proapoptotic a moleculelor ntregi de CIDE este inhibat de ctre DFF 45, CIDE C singura induce apoptoza, ceea ce sugereaz o funcie reglatorie a CIDE N.

CIDE N are 5 lanuri pliate i 2 helixuri, aranjate ntr-o pliere /. Studii NMR au evideniat faptul c CIDE N reacioneaz cu CIDE N din DFF 45 sau DFF 40. Suprafaa de contact este polar i are dou regiuni de semn contrar. Juxtapunerea inedit a regiunilor bazice i acide sugereaz o interacie bipolar electrostatic.

Lanurile 1 i 2 sunt legate printr-o bucl i formeaz un ac de pr n structur pliat, helixul 1 este mpachetat n mod antiparalel fa de lanurile 4, 5, 6, iar segmentul 5 este paralel cu o parte din segmentul 1 i formeaz un complex pliat.

Fenilalaninele 38, 39, 90 sunt incluse n nucleul hidrofob al moleculei, triptofanul 108 mpacheteaz bucla carboxiterminal nteracionnd cu valina 76, alanina 83 i metionina 100 din lanurile 3 i 5.

Reziduurile aromatice 90 i 108 sunt conservate n toat familia CIDE, mutaiile la acest nivel afectnd capacitatea nucleazic.

c) FRAGMENTAREA INTERNUCLEOZOMALA A ADN

O alt dogm a studiilor despre apoptoz a fost aceea a oligonucleozomizrii. Studiul lui Oberhammer a evideniat o fragmentare la nivelul de 300 Kpb i 50 Kpb nainte de clivarea internucleozomal. Existena a dou tipuri de lungime a fost explicat prin funcionarea a dou nucleaze diferite sau prin diferena topologic a cromatinei. 1n timp ce clivarea la nivelul segmentelor 300 Kpb era explicata prin localizarea la nivelul ADN a topoizomerazei II la distane de 300 Kpb, facilitnd detaarea de proteinele scaffold, existena fragmentelor de 50kpb se datora functonarii unor nucleaze specializate. Alti cercetatori au observat ca pe masura ce cantitatea de fragmente 300kpb scadea, cea de 50kpb crestea, ceea ce justific ipoteza derivrii fragmentelor de 50 Kpb din primele. 2Alte studii au artat c fragmentarea ADN este independent de clivarea ADN linker i c ultima depinde de aciunea unor factori adiionali care afecteaz conformaia nucleozomal.

Celulele 10T intrate n apoptoz nu puteau fi distinse de timocitele n aceeasi situatie, cnd analiza se fcea cu o mrire de cca. 25000 de ori la microscop.

ADN extras din 10T apoptozate (celule embrionare murine pluripotente) era dublu catenar, de aproximativ 20 Kp, fr clivri internucleozomale, existnd modificri monocatenare prin introducerea siturilor senzitive alkaline ca i a celor S1 hipersenzitive. Analiza ADN denaturat termic n gel de formaldehid a artat existenta unor fragmente mai mici de 400 baze n celule apoptotice, ceea ce sugereaz c cele doua tipuri de situsuri senzitive sunt n aceleai regiuni, ocurena lor fiind de 177 180 pb. 3 Introducerea unor situsuri abazice n regiunea linker constituie o etap intermediar n degradarea ADN, ceea ce sugereaza ipoteza ca clivarea internucleozomal nu este universal.

Situsurile S1 hipersenzitive sunt asociate cu modificri n conformaia ADN prin tranziii B Z, ceea ce produce afectarea torsiunii ADN i modificri helicale, datorit introducerii unor repetiii de purine i guanidine identice. Asemenea situsuri pot explica dispariia H1 n apoptoz. 4d) ICAD

Au fost identificate pn acum dou forme de ICAD, L i S, care difer prin lungime (331 respectiv 269 aminoacizi), si care sunt traduse de pe dou ARNm diferite, produse prin splicing alternativ. 5ICAD L este necesar pentru producerea unui CAD funcional, nu S insa, facilitndu-i plierea corect. Probabil c ICAD S funcioneaz ca un factor de reglare negativ a funciei chapperone a ICAD L, sau probabil c ICAD L este translat preferenial n celule ce vor intra n apoptoz.

Liniile celulare din timocite DFF 45 deficiente sunt rezistente la fragmentarea ADN n urma tratamentului cu dexametazon i au trsturi distincte fa de tipul slbatic.

Au fost identificai mai muli factori cu funcie n apoptoza nuclear.

e) Acinus 6 este un precursor al unui factor de condensare nuclear, clivarea lui la Asp 1093 de ctre caspaza 3 fiind un pas necesar dar nu i suficient pentru activarea sa. O proteaz nc necunoscut cliveaz Ser 987, elibernd subunitatea activ.

f) DN-aza II 7 deriv de asemenea dintr-un inhibitor proteazic al elastazei leucocitare, printr-o modificare posttranslaional care este declanat de o acidifiere citosolic, o modificare metabolic ce nsoete adesea apoptoza, i care adugat la nucleii purificai determin condensarea cromatinei i nglobarea ei n fragmente cromozomale.

g) Catepsina B 8 este activat prin eliberarea sa din lizozomi i are funcie similar.

h) AIF 9 este de asemenea un factor de inducere a condensrii cromatinei independent de caspaze.

i) Modificari nucleozomale

Un proces important n condensarea cromatinei l constituie fosforilarea histonelor cromozomale. 10H1 este n mod normal fosforilat de ctre cdc 2 / H1 Kinaza, atingand un maxim n mitoz, mai ales la segmentele carboxi- i animoterminale, H3 este fosforilat la nivelul Ser 10 n segmentul aminoterminal si in cazul condensarii premature a cromozomilor, iar H2A in mod constant de-a lungul intregului ciclu celular. H3 n apoptoz nu mai este fosforilat la nivelul situsurilor uzuale .

H2B este un marker important n apoptoz deoarece este fosforilat n mod distinct la nivelul Ser32, specific pentru apoptoz. Procesul debuteaz cu o fosforilare n momentul fragmentrii ADN la nivel nucleozomal, fiind inhibat de 2 Asp CH2 DCB, un inhibitor nespecific al ICE. nc nu se cunoate mecanismul exact. Probabil ca fosforilarea H2B faciliteaza disocierea partiala a ADN linker si faciliteaza fragmentarea endonucleazica.

DFF 40/45

oarecii knock-out DFF 45 sunt deficieni n ceea ce privete condensarea cromatinei sau fragmentarea ADN, iar existena omologilor sau a altor sisteme nucleazice nu este suficient. 11DFF 45 este un inhibitor al lui DFF 40, iar studii aprofundate au demonstrat funcia sa de protein chapperone. De asemenea DFF 45 are o funcie important n sinteza DFF 40, n plierea i n localizarea sa corect.

Activarea DFF 40 necesit activarea caspazei 3 care cliveaz DFF 45 la nivelul aminoacizilor 117 i 224. 12DFF a fost identificat prin experiene n care nuclei normali din ficat de hamster au fost incubai cu HeLa S 100. Caspaza 3 nu putea induce singur fragmentarea ADN i nici fracia citosolic din HeLa.

Dup incubarea cu caspaza 3 DFF 45 a fost n dou fragmente, de 30, respectiv 11 KDal, i ulterior a fost cuantificat reducerea cantitatii de 30 KDal, i marirea celei de 11 KDal, ceea ce a sugerat c fragmentul mare este un intermediar pentru cel mic. 13

DFF 45 are un ORF de 331 de aminoacizi, cu o structur inedit. DFF este localizat citosolic, iar dup activare este transportat n nucleu, unde este implicat n degradarea cromatinei.

Studii genetice au identificat o gen CAD pe 1p 36.3, asociat cu o pseudogen, iar deleia acestui fragment a fost indentificat n numeroase tumori, mai ales n neuroblastoma.

Are o funcie DN-azic intrinsec, 14 dar analiza BLAST a identificat un domeniu de omologie de 80 de aminoacizi cu proteina murin, localizat n regiunea aminoterminal. Aceste molecule au o identitate de 43,3 %, ntre 24 83.

DFF este similar DN-azelor bacteriene care sunt codificate de ctre genele colicinelor i care sunt sintetizate cuplat cu inhibitorii specifici i cu NFkB IKB.

Capacitatea este accelerat de adugarea H1 i HMG. DFF 40 induce condensarea cromatinei cnd este adugat la nuclei izolai, proces care nu este inhibat de Z VAD FMF, ce determin blocarea aciunii AIF. 159. Noi familii de gene

n ultima perioad au fost descoperite noi familii de gene la Drosophila melanogaster, cum ar fi REAPER, HID i GRIM, care codific pentru inductori puternici ai apoptozei, n cursul dezvoltrii embrionare.

Reaper este o molecul mic (65 aminoacizi), cu o secven inedit, neavnd omologi la celelalte specii i fr funcie catalitic evident.1 Se leag la o protein numit SCYTHE, 2 care elibereaz citocromul c, disociind complexul Scythe represor. Scythe se leag de asemenea i la alte dou proteine cu funcie reglatoare, GRIM i Hid.

GRIM 3 este o protein citoplasmatic care n timpul apoptozei este traslocat n mitocondrie, putnd fi clivat de ctre caspaze la nivelul domeniului carboxiterminal. GRIM nu necesit activarea p 53, iar GRIM, hip i reaper acioneaz prin inhibarea Drosophila IAP (DIAP1) .4La Drosophila melanogaster a mai fost identificat un factor reglator DREP 1 5, omolog DFF 45, care inhib apoptoza indus de CIDE A.

11