Antikörperverlauf in Mäusen, Ratten und Schweinen nach Applikation von Enzephalomyokarditis-Viren

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    30-Sep-2016

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  • Zbl. Vet. Med. B, 25, 547-554 (1978) @ 1978 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0514-7166/ASTM-Coden: ZVRBAZ

    Aus dem Znstitut fur Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universitat Diisseldorf Direktor: Prof. Dr. P. Naumann

    Antikorperverlauf in Mausen, Ratten und Schweinen nach Applikation von Enzephalomyokarditis-Viren

    Von

    H. TESCHNER, SIBYLLE SCHULZ und W. A. K. SCHMIDT

    Mit 6 Abbildungen

    (Eingegangen am 27. Juni 1977)

    Einleitung Das zu den Picornaviren gehorende Enzephalomyokarditis (EMC)-Virus

    hat sein naturliches Reservoir bei den Nagern (WARREN u. Mitarb., 1949), an- dere Spezies ziehen sich die Infektion von diesen zu.

    Verschiedene Autoren berichteten aus Panama (MURNANE u. Mitarb., 1960), aus Florida (GAINER u. Mitarb., 1961) und aus Australien (ACLAND U. Mitarb., 1970, 1975) uber eine hohe Sterblichkeitsrate bei Schweinen nach einer naturlichen Infektion mit dem EMC-Virus. Todesursache war stets eine schwere Myokarditis. Diese Diagnose konnten WATT und Mitarbeiter (1974) ebenfalls bei Schweinen, SPRADBROW und Mitarbeiter (1 970) bei Kalbern und CRAIGHEAD (1 966) bei Mausen experimentell bestatigen.

    BURCH und Mitarbeiter (1971) stellten bei Versuchen an EMC-Virus- infizierten Mausen fest, dai3 das Virus neben dem Herzmuskelgewebe beson- ders das der Herzklappen befallt. Gleichzeitig berichteten sie uber Nieren- schadigung wie Zerstorung der Glomerula, Tubulusepithelien und Intersti- tialzellen.

    Da neben den klinischen Erscheinungen und pathologischen Verande- rungen auch eine immunologische Antwort auf die Virusinfektion nachzu- weisen ist, wurde diesem Problem in der vorliegenden Arbeit besondere Auf- merksamkeit geschenkt. Es wird uber die Bildung und Persistenz latexagglu- tinations- und hamagglutinationshemmender Antikorper in Mausen, Ratten und Schweinen nach einmaliger Applikation von Enzephalomyokarditis-Virus berichtet.

    U. S . Copyright Clearance Center Code Staterncnt: 05 14-7166/78/2507-0547$02.50/0

  • 548 H. TESCHNER, SIBYLLE SCHULZ und W. A. K. SCHMIDT

    Material und Methoden Versuchstiere

    Als Versuchstiere standen Mause, Ratten und Schweine zur Verfiigung. 120 Mause des Stammes DBA/2 J/BOM, mannlichen Geschlechts, 6-8 Wochen alt, mit einem Gewicht von je 20-21 g (Fa. G1. Bomholtgard Ltd., Ry, Dane- mark) wurden in Gruppen zu je zehn Tieren in Makrolonkafigen Typ IV ge- halten. Als Bodeneinstreu diente Holzgranulat. Entsprechend war die Haltung von 40 weiblichen Ratten rnit einem Gewicht von je 200 g. Sie stammten aus eigener Zucht des Tierversuchshauses der Universitat Dusseldorf.

    Die fiinf weiblichen, 8 Wochen alten Miniaturschweine, je 8-10 kg schwer vom Versuchsgut Relliehausen der Universitat Gottingen wurden in einer vierteiligen Kafiganlage (Fa. Ehret, Emmendingen) gehalten.

    Leitungswasser stand allen Tieren ad libidum zur Verfugung, ebenfalls das Fertigfutter (Fa. Hoveler) den Mausen und Ratten. Die Fiitterung der Schweine erfolgte 2 >( am Tag (Schweinefutter Spezial S , Hoveler).

    Virus und Virusvermehrung Verwendet wurde die nach MUNTEFERING und Mitarbeiter (1971) ge-

    wonnene 2. Herzpassage der M-Variante des Enzephalomyokarditisvirus. Die Vermehrung erfolgte iiber zwei Passagen in H. Ep.-2-Zellen. Als Wachstums- medium diente Basal Medium (Eagle) mit EARLES Salzen, L-Glutamin (Powder Medium F-11, GIBCO) und einem Zusatz von l o o / , fotalem Kalberserum. Das Erhaltungsmedium enthielt 2 O / o fotales Kalberserum.

    Verimpft wurde auf gut ausgebildete Zellkulturen in Rollflaschen. Nach zweitagiger Bebrutung bei 37 O C und vollstandiger Ausbildung des cytopa- thischen Effektes wurde die geerntete Antigensuspension (Rohantigen) in klei- ne Portionen abgefiillt, bei - 70 O C gelagert und vor Gebrauch durch Zentri- fugation (10 Min. 2000 g) vom Zelldetritus befreit.

    Gewinnung der Immunseren Alle Tiere wurden mit einer 1 : 100 verdiinnten EMC-Virussuspension

    aus der zweiten Gewebepassage infiziert. Die ID,, betrug 1059222/0,25 ml. Die Mause erhielten 0,5 ml der Antigensuspension intraperitoneal, den Ratten wurde 1 ml in die Schwanzvene appliziert. Zwei Schweinen wurden 0,5 ml Suspension intraperitoneal, den anderen beiden 0,5 ml in die Ohrvene verab- reicht. 20 Mause, 10 Ratten und 1 Schwein wurden wie oben beschrieben als Kontrolltiere mit Leerantigen beimpft.

    Zum Antikorpernachweis wurde den Mausen aus dem retroorbitalen Venenplexus, den Ratten durch Punktion der Schwanzvene und den Schweinen durch Punktion der Ohrrandvene in regelmaaigen Abstanden Blut entnom- men.

    Serum f raktionierung im Sarcharose-Dichtegradienten Die Trennung der Immunglobuline G und M wurde im Saccharose-

    Dichtegradienten in 5 ml Zellulosenitratrohrchen vorgenommen. Die Herstel- lung eines linearen Gradienten von 4,8 ml aus einer 12,5- und einer 37 O/oigen Zuckerlosung in 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,O + 0,9 O/o NaCl erfolgte mit- tels des ISCO-Gradientenformers 5 700 G (Colora). Anschlieaend wurden 0,2 ml Serum dem Gradienten aufgesetzt. Die Zentrifugationsdauer betrug 16 Stunden bei 180 000 g (Beckmann Ultrazentrifuge, Rotor SW 50.1). Die Entnahme erfolgte mittels Gradientenabnehmer (Beckmann); 20 Fraktionen zu je 0,25 ml wurden entnommen. Zur Kontrolle des Gradientenverlaufes wurde

  • Antikorperverlauf in Mausen, Ratten und Schweinen 549

    der Refraktionsindex im Zeii3-Abbe Refraktometer bestimmt, wobei jede Fraktion gemessen wurde. Anschliei3end wurden jeder Fraktion 0,25 ml Phos- phatpuffer pH 7,O + 0,9 O/o NaCl zugefiigt.

    In jedem Lauf befand sich ein IgG- und IgM-haltiges Kontrollserum, von dem samtliche Fraktionen im HAH-Test auf Antikorperaktivitat getestet wurde, um die Lage der IgG- und IgM-Maxima zu ermitteln. Die entsprechen- den Fraktionen bei den ubrigen Seren wurden auf Grund des Refraktions- indexes entnommen. Jeweils 5 Fraktionen mit IgG oder IgM wurden im LAH- und HAH-Test austitriert.

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    Antikorperbestimmung Die latexagglutinationshemmenden (LAH)-Antikorper wurden nach

    einem von SCHMIDT und KLEIN (1974) entwickelten Nachweisverfahren er- mittelt. Die hamagglutinationshemmenden Antikorper wurden nach einer von CRAIGHEAD und SHELOKOV (1 961) fur das EMC-Virus beschriebenen Mikro- methode bestimmt.

    - - - - - -

    LAH

    I I , . I I I I o i I 7 10 * 17 24 31 - SQ 87 i is 143 in

    Ergebnisse Abbildung 1 zeigt den Antikorperverlauf bei Mausen. Jeweils drei Tiere

    wurden entblutet. Die eingetragenen Daten ergeben sich aus dem geometrischen Mittelwert.

    Die LAW- und die HAH-Antikorper konnten bereits am 4. Tag p. i. nachgewiesen werden. Der LAH-Antikorpertiter lag schon in den ersten Tagen wesentlich hoher als der HAH-Antikorpertiter und erreichte sein Maximum bereits am 16.--19. Tag p. i., der HAH-Antikorpertiter erst zwischen dem 39.-60. Tag p. i. Ihre Verweildauer war ebenfalls unterschiedlich. Die latex- agglutinationshemmenden Antikorper waren schon am 53. Tag signifikant ab- gesunken, wahrend die hamagglutinationshemmenden Antikorper erst vom 60. Tag langsam abnahmen. Die Kontrolltiere bildeten wahrend der gesamten Versuchsdauer keine Antikorper.

    Abbildung 2 zeigt das zeitliche Erscheinen und die Persistenz von LAH- und HAH-Antikorpern bei Ratten. Die eingetragenen Werte stellen den geometrischen Mittelwert einer Gruppe von 10 Tieren dar.

  • 550 H. TESCHNER, S~BYLLE SCHULZ und W. A. K. SCHMIDT

    LO% -

    Am 4. Tag p. i. traten LAH-Antikorper auf, stiegen schnell an und er- reichten ihr Maximum zwischen dem 17. und 31. Tag p. i. Die HAH-Antikor- per konnten ebenfalls am 4. Tag p. i. nachgewiesen werden. Der Verlauf ihrer Bildung entsprach dem der LAH-Antikorper, die Titer lagen jedoch etwas niedriger. Auch in ihrer Persistenz zeigten sich Unterschiede. Die LAH-Anti-

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    TAGE NACH VIRUSAPPLIKATION

    Abb. 4. Bildung und Persistenz latexaggluti- nations- und hamagglutinationshemmender Antikorper in Schwein Nr. 2 nach i. p. Appli-

    kation von Enzephalomyokarditisvirus

  • Antikorperverlauf in Mausen, Ratten und Schweinen 5 5 1

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    korpertiter waren schon zwischen dem 31. und 59. Tag p. i. auf 25 010 ihres Hochstwertes abgesunken. Die HAH-Antikorpertiter hingegen nahmen iiber den gesamten beobachteten Zeitraum nur sehr langsam ab. Einen Abfall auf '/4 ihres Maximalwertes erreichten sie wahrend der gesamten Versuchsdauer nicht. LAH- und HAH-Antikorper waren bei den Kontrolltieren nicht nach- zuweisen.

    Die Abbildungen 3-6 zeigen den LAH- und HAH-Antikorperverlauf bei 4 Schweinen.

    Die latexagglutinationshemmenden Antikorper konnten im Vollserum bereits am 6. Tag p. i. mit hohen Titern nachgewiesen werden, erreichten ihr Maximum zwischen dem 6. und 9. Tag nach Inokulation und waren bereits am 19.-26. Tag auf 25 O/o ihres Hochstwertes abgesunken. Die hamagglu- tinationshemmenden Antikorper waren ebenfalls am 6. Tag p. i. nachzuweisen und erreichten ihr Maximum am 9.--12. Tag nach Inokulation, sanken dann aber unterschiedlich schnell, am 19. bzw. 47. Tag, ab.

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    TAGE NACH VIRUSAPPLIKATION

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    6.2 -

    Abb. 6. Bildung und Persistenz latexaggluti- nations- und hamagglutinationshemmender Antikorper in Schwein Nr. 4 nach i. v. Appli-

    kation von Enzephalomyokarditisvirus

    Virusspezifische IgM-Antikorper waren zwischen dem 3.-6. Tag nach Inokulation des EMC-Virus im LAH- bzw. HAH-Test nachweisbar. Sie erreichten ihr Maximum zwischen dem 9. und 12. Tag p. i., fielen dann schnell ab und waren nach 3 3 Tagen im HAH-Test und nach 40 Tagen im LAH-Test nicht mehr oder nur mit geringem Titer festzustellen. Hamagglutinations- hemmende Antikorper vom IgG-Typ traten nach 9 Tagen in Erscheinung. Sie erreichten ihr Maximum am 19.-26. Tag und folgten dem Titerverlauf im Vollserum. Latexagglutinationshemmende Antikorper vom IgG-Typ waren wahrend der gesamten Versuchsdauer nicht nachzuweisen.

  • 552 H. TESCHNER, SIBYLLE SCHULZ und W. A. K. SCHMIDT

    Im Serum des Kontrolltieres konnten uber den ganzen Versuchszeit- raum weder LAH- noch HAH-Antikorper festgestellt werden.

    Diskussion Die Bildung und Persistenz von latexagglutinations- (LAH) und hamag-

    glutinationshemmenden (HAH) Antikorpern wurde bei Mausen, Ratten und Schweinen nach einmaliger Gabe von EMC-Virus verfolgt. Nach Unter- suchungen von SCHMIDT und Mitarbeiter (1975) am Kaninchen verhielten sich die LAH- und HAH-Antikorper im zeitlichen Erscheinen und im Anstieg gleich, unterschiedlich war jedoch die Persistenz. War der LAH-Antikorper- titer schon nach 8 Wochen auf '/4 seines Maximalwertes abgesunken, traf dieses fur den HAH-Antikorpertiter erst zu einem wesentlich spateren Zeitpunkt zu. Diese Ergebnisse bestatigen sich bei den Versuchen an Mausen, Ratten und Schweinen nach Applikation von EMC-Virus.

    Die Feststellung von MUNTEFERING und Mitarbeiter (1971), daf3 Mause gute HAH-Antikorperbilner sind, konnte untermauert werden. Der Abfall der Titer begann jedoch zu einem fruheren Zeitpunkt, als von diesen Autoren beschrieben wurde.

    Bei den Ratten hat sich die Beobachtung von CRAIGHEAD (1965), diese Tierspezies bilde nur geringe oder kaum nachweisbare HAH-Antikorper, nicht bestatigt. Hohe Antikorpertiter waren uber einen langeren Versuchszeitraum festzustellen.

    Bei dem Nachweis von LAH- und HAH-Antikorpern bei Schweinen wurde im Vollserum eine ahnliche Antikorpervermehrung gefunden, wie sie von BRADE und Mitarbeiter (1975) beim Kaninchen beobachtet worden war. Ebenso stimmte der HAH-Antikorperverlauf teilweise mit dem von SDRAD- BKOW und Mitarbeiter (1 970) bei Kalbern beschriebenen Verlauf uberein. Virusspezifische Antikorper vom IgM-Typ erreichten in kurzer Zeit ihr Maxi- mum, fielen dann schnell ab und waren nach wenigen Wochen nicht mehr nach- zuweisen. Abweichend in Bildung und Persistenz verhielten sich die LAH- und HAH-Antikiirper vom IgG-Typ. Die HAH-Antikorper folgten nach Er- reichen eines Maximums dem Verlauf der Antikorper im Vollserum. LAH- Antikorper vom IgG-Typ waren nicht nachzuweisen; dies konnte darauf zuruckzufuhren sein, das die den Schweinen verabreichte Dosis zu gering war, urn die Bildung von LAH-Antikorpern vom IgG-Typ anzuregen.

    Unterschiede in der Antikorperbildung auf Grund der Applikationsform (intravenos, intraperitoneal) konnten nicht festgestellt werden.

    Bei auftretenden Erkrankungen des ZNS oder des Herzens sollte beim Tier eine Infektion durch das EMC-Virus mit in Betracht gezogen werden. Als empfindlicher Nachweis bietet sich der LAH-Test an. LAH- und HAH- Antikorper steigen zwar gleich schnell an, die LAH-Antikorper fallen aber im Gegensatz zu den HAH-Antikorpern zu einem wesentlich fruheren Zeitpunkt signifikant ab. Wegen des schnellen Anstieges von LAH- und HAH-Anti- korpern ist es kaum moglich bei Entnahme von zwei Seren zu unterschiedlichen Zeiten einen vierfachen Titeranstieg zu beobachten. Deshalb bietet sich der LAH-Test fur die Diagnostik als Methode der Wahl an, mit dem sich eine akute Infektion durch Nachweis eines signifikanten Titerabfalls feststellen lafit. Aui3erdem waren in dem gleichen Test nachzuweisende Antikorper vom IgM-Typ fur einen akuten Infekt beweisend.

    Zusammenfassung Die Bildung und Persistenz von Antikorpern in Mausen, Ratten und

    Schweinen nach einmaliger Applikation von Enzephalomykarditis-Virus

  • Antikorperverlauf in Mausen, Ratten und Schweinen 5 5 3

    wurde im Latex-Agglutinations- und Hamagglutinationshemmtest untersucht. Im Vollserum erschienen die getesteten Antikorper etwa zur gleichen Zeit,

    verweilten jedoch unterschiedlich lange. Bei Schweinen wurden zusatzlich virusspezifische Antikorper vom IgG- und IgM-Typ untersucht. Die IgM- Antikorper zeigten im LAH- und HAH-Test einen einheitlichen Verlauf. Die HAH-Antikorper vom IgG-Typ traten spater auf und folgten dem Verlauf der Titer im Vollserum. LAH-Antikorper des gleichen Typs konnten nicht nachgewiesen werden.

    Es hat sich gezeigt, dai3 eine Infektion im LAH- und HAH-Test schon zu einem fruhen Zeitpunkt nachgewiesen werden kann, wobei sich der LAH-Test als der bessere Nachweis von beiden fur die Diagnostik herausstellte.

    Wir danken dem Leiter der Tierversuchsanlage, Herrn Dr. H. BIENICK, und Frau Dr. B. TOBER-MEYER fur ihre Unterstutzung bei der Durchfuhrung der Tierversuche.

    Summary Course of antibodies in mice, rats and pigs infected with encephalomyocarditis-viruses

    The formation and persistence of antibodies produced in mice, rats and pigs after a single dosis of encephalomyocarditis virus were tested compar- atively by the latex agglutination-inhibition-test and hemagglutination- inhibition-test.

    In the original...

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